หลักการของวิธีการ (พื้นฐานทางอณูชีววิทยา)

ในบรรดาวิธีการผสมพันธุ์ที่หลากหลายสำหรับการวิเคราะห์ดีเอ็นเอ PCR เป็นวิธีการวินิจฉัยทางห้องปฏิบัติการทางคลินิกที่ใช้กันอย่างแพร่หลายมากที่สุด

หลักการวิธีการ ปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรส (PCR)(ปฏิกิริยาลูกโซ่พอลิเมอเรส (PCR)) ได้รับการพัฒนาโดย Cary Mullis (Cetus, USA) ในปี 1983 และปัจจุบันใช้กันอย่างแพร่หลายสำหรับ การวิจัยทางวิทยาศาสตร์และสำหรับการวินิจฉัยในการดูแลสุขภาพภาคปฏิบัติและการบริการของการกำกับดูแลด้านสุขอนามัยและระบาดวิทยาของรัฐ (genotyping การวินิจฉัยโรคติดเชื้อ)

วิธี PCR นั้นใช้กระบวนการทางธรรมชาติ - การเติมเต็มเทมเพลต DNA ให้สมบูรณ์ ซึ่งดำเนินการด้วยความช่วยเหลือของเอนไซม์ DNA polymerase ปฏิกิริยานี้เรียกว่า การจำลองแบบดีเอ็นเอ

การจำลองแบบ DNA ตามธรรมชาติประกอบด้วยหลายขั้นตอน:

1) การเสื่อมสภาพของดีเอ็นเอ(คลายเกลียวคู่, ความแตกต่างของสายดีเอ็นเอ);

2) การก่อตัวของส่วน DNA สองสายสั้น(เมล็ดพันธุ์ที่จำเป็นในการเริ่มต้นการสังเคราะห์ดีเอ็นเอ);

3) การสังเคราะห์สาย DNA ใหม่(เสริมความสมบูรณ์ของทั้งสองเส้น)

กระบวนการนี้สามารถใช้ทำสำเนาได้ ส่วนสั้นของ DNA ที่จำเพาะต่อจุลินทรีย์จำเพาะเหล่านั้น. เพื่อดำเนินการค้นหาเป้าหมายสำหรับพื้นที่เฉพาะดังกล่าวซึ่งเป็นเป้าหมายของการวินิจฉัยยีนเพื่อระบุเชื้อโรคของโรคติดเชื้อ

การค้นพบ DNA polymerase ที่ทนความร้อนได้ (Taq polymerase) จากแบคทีเรียที่ชอบความร้อน เทอร์มิส อะควาติคัสค่าที่เหมาะสมที่สุดอยู่ที่ 70-72°C ทำให้กระบวนการของการจำลองดีเอ็นเอเป็นวัฏจักรและใช้สำหรับการทำงานในหลอดทดลองได้ การสร้างเทอร์โมสแตทแบบตั้งโปรแกรมได้ (แอมพลิฟายเออร์) ซึ่งตามโปรแกรมที่กำหนด ทำการเปลี่ยนแปลงของอุณหภูมิแบบวัฏจักร สร้างข้อกำหนดเบื้องต้นสำหรับการแนะนำวิธี PCR อย่างกว้างขวางในการปฏิบัติการวินิจฉัยทางคลินิกในห้องปฏิบัติการ ด้วยวงจรการสังเคราะห์ซ้ำๆ กัน จำนวนสำเนาของชิ้นส่วนดีเอ็นเอจำเพาะจะเพิ่มขึ้นแบบทวีคูณ ซึ่งทำให้ได้สำเนา DNA จำนวนที่เพียงพอจากวัสดุที่วิเคราะห์จำนวนเล็กน้อย ซึ่งอาจมีเซลล์จุลินทรีย์เพียงเซลล์เดียว เพื่อระบุตัวตนด้วยอิเล็กโตรโฟรีซิส

ความสมบูรณ์ของสายโซ่ไม่ได้เริ่มต้นที่จุดใดๆ ในลำดับ DNA แต่เฉพาะในบล็อกเริ่มต้นบางช่วงเท่านั้น - ส่วนที่เป็นเกลียวคู่แบบสั้น โดยการติดบล็อคดังกล่าวกับบริเวณเฉพาะของ DNA เป็นไปได้ที่จะชี้นำกระบวนการสังเคราะห์สายใหม่เฉพาะในภูมิภาคนี้เท่านั้น และไม่สามารถกำหนดตามความยาวทั้งหมดของสาย DNA ในการสร้างบล็อคเริ่มต้นในบริเวณ DNA ที่กำหนด จะใช้ไพรเมอร์โอลิโกนิวคลีโอไทด์สองคู่ (20 คู่นิวคลีโอไทด์) เรียกว่า ไพรเมอร์ไพรเมอร์เป็นส่วนเสริมของลำดับ DNA บนขอบเขตด้านซ้ายและขวาของชิ้นส่วนเฉพาะ และถูกจัดวางในลักษณะที่ความสมบูรณ์ของสาย DNA ใหม่จะเกิดขึ้นระหว่างพวกมันเท่านั้น

ดังนั้น PCR จึงเป็นการเพิ่มจำนวนสำเนา (การขยาย) ของบริเวณ DNA จำเพาะที่เร่งปฏิกิริยาโดยเอนไซม์ DNA polymerase เพิ่มขึ้นหลายเท่า

ส่วนประกอบต่อไปนี้จำเป็นสำหรับการขยายสัญญาณ:

ส่วนผสมของดีออกซีนิวคลีโอไทด์ ไตรฟอสเฟต (dNTPs)(ส่วนผสมของ dNTP สี่ตัว ซึ่งเป็นวัสดุสำหรับการสังเคราะห์สาย DNA เสริมใหม่)

เอนไซม์แท็คพอลิเมอเรส( DNA polymerase ที่ทนความร้อนได้ซึ่งกระตุ้นการยืดของสายไพรเมอร์โดยการเพิ่มเบสของนิวคลีโอไทด์ตามลำดับไปยังสายโซ่ที่เติบโตขึ้นของ DNA ที่สังเคราะห์ขึ้น)

สารละลายบัฟเฟอร์(ตัวกลางทำปฏิกิริยาที่มี Mg2+ ไอออนที่จำเป็นต่อการรักษาการทำงานของเอนไซม์)
เพื่อตรวจสอบบริเวณเฉพาะของจีโนมของไวรัสที่มี RNA สำเนา DNA จะได้รับจากเทมเพลต RNA ก่อนโดยใช้ปฏิกิริยาการถอดรหัสแบบย้อนกลับ (RT) ที่เร่งปฏิกิริยาโดยเอนไซม์ reverse transcriptase (reverse transcriptase)

เพื่อให้ได้สำเนาของชิ้นส่วนดีเอ็นเอที่มีลักษณะเฉพาะที่ต้องการในจำนวนที่เพียงพอ การขยายเสียงรวมถึงหลายรอบ (20-40)

รอบการขยายเสียงแต่ละรอบประกอบด้วย 3 ขั้นตอนที่ดำเนินการในสภาวะอุณหภูมิที่แตกต่างกัน ขั้นตอนที่ 1: DNA Denaturation(คลายเกลียวคู่) ไหลที่อุณหภูมิ 93-95 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 30-40 วินาที ขั้นที่ 2: การติดไพรเมอร์ (การหลอม)สิ่งที่แนบมากับไพรเมอร์เกิดขึ้นพร้อมกับลำดับที่สอดคล้องกันบนสาย DNA ตรงข้ามที่ขอบเขตของไซต์เฉพาะ ไพรเมอร์แต่ละคู่มีอุณหภูมิการอบอ่อนของตัวเอง โดยมีค่าอยู่ในช่วง 50-60 องศาเซลเซียส เวลาในการหลอม -20-60 วินาที ขั้นตอนที่ 3: การสร้างสายโซ่ DNAความสมบูรณ์ของสายโซ่ DNA เกิดขึ้นจากปลายสาย 5' ถึงปลายสาย 3' ในทิศทางตรงกันข้าม โดยเริ่มจากบริเวณที่มีสิ่งที่แนบมาด้วยไพรเมอร์ วัสดุสำหรับการสังเคราะห์สาย DNA ใหม่คือดีออกซีไรโบนิวคลีโอไทด์ ไตรฟอสเฟต (dNTPs) ที่เติมลงในสารละลาย กระบวนการสังเคราะห์ถูกเร่งโดยเอนไซม์ DNA polymerase ที่ทนความร้อนได้ (Taq polymerase) และเกิดขึ้นที่อุณหภูมิ 70-72°C เวลาสังเคราะห์ - 20-40 วินาที

สาย DNA ใหม่ที่เกิดขึ้นในวงจรการขยายสัญญาณแรกทำหน้าที่เป็นแม่แบบสำหรับวงจรการขยายที่สอง ซึ่งจะสร้างชิ้นส่วน DNA เฉพาะที่ต้องการ (แอมพลิคอน) (ดูรูปที่ 2). ในรอบการขยายเสียงที่ตามมา แอมพลิคอนทำหน้าที่เป็นแม่แบบสำหรับการสังเคราะห์เชนใหม่ ดังนั้น การสะสมของแอมพลิคอนในสารละลายจึงเกิดขึ้นตามสูตร 2n โดยที่ n คือจำนวนรอบการขยาย ดังนั้น แม้ว่าในตอนแรกจะมีโมเลกุลดีเอ็นเอแบบสองสายเพียงตัวเดียวในสารละลายเริ่มต้น โมเลกุลแอมพลิคอนประมาณ 108 โมเลกุลก็สะสมอยู่ในสารละลายหลังจากผ่านไป 30-40 รอบ ปริมาณนี้เพียงพอสำหรับการตรวจจับด้วยตาเปล่าของชิ้นส่วนนี้โดย agarose gel electrophoresis กระบวนการขยายเสียงจะดำเนินการในเทอร์โมสตัทแบบตั้งโปรแกรมได้พิเศษ (เครื่องขยายสัญญาณ) ซึ่งตามโปรแกรมที่กำหนด อุณหภูมิจะเปลี่ยนโดยอัตโนมัติตามจำนวนรอบการขยายเสียง

ขั้นตอนของ PCR - การวิเคราะห์

วิธี PCR เป็นเครื่องมือสำหรับการวินิจฉัยทางห้องปฏิบัติการของโรคติดเชื้อ อาศัยการตรวจหาชิ้นส่วนดีเอ็นเอขนาดเล็กของเชื้อโรค (หลายร้อยคู่เบส) เฉพาะสำหรับจุลินทรีย์นี้เท่านั้น โดยใช้ปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรสเพื่อสะสมชิ้นส่วนที่ต้องการ .
เทคนิคการวิเคราะห์โดยใช้วิธี PCR ประกอบด้วยสามขั้นตอน:

1. การแยก DNA (RNA) จากตัวอย่างทางคลินิก

2. การขยายชิ้นส่วนดีเอ็นเอจำเพาะ
3. การตรวจจับผลิตภัณฑ์ขยายเสียง

การแยก DNA (RNA)
ในขั้นตอนนี้ของการวิเคราะห์ ตัวอย่างทางคลินิกจะต้องผ่านกระบวนการพิเศษ ซึ่งส่งผลให้เกิดการสลายของวัสดุเซลล์ การกำจัดโปรตีนและเศษส่วนโพลีแซ็กคาไรด์ และการเตรียมสารละลาย DNA หรือ RNA ที่ปราศจาก
สารยับยั้งและพร้อมสำหรับการขยายเพิ่มเติม
การเลือกเทคนิคการสกัด DNA (RNA) ส่วนใหญ่จะพิจารณาจากลักษณะของวัสดุทางคลินิกที่ผ่านกรรมวิธี

การขยายชิ้นส่วนดีเอ็นเอจำเพาะ
ในขั้นตอนนี้ ชิ้นส่วนดีเอ็นเอจำเพาะสั้นๆ จะถูกสะสมในปริมาณที่จำเป็นสำหรับการตรวจจับต่อไป วิธีการส่วนใหญ่ในการพิจารณาชิ้นส่วนเฉพาะของจีโนมใช้สิ่งที่เรียกว่า “ PCR ที่แนะนำรุ่นคลาสสิก เพื่อเพิ่มความจำเพาะและความไวของการวิเคราะห์ วิธีการบางอย่างใช้วิธี PCR "ซ้อน" ซึ่งใช้ไพรเมอร์ 2 คู่ ("ภายนอก" - สำหรับระยะที่ 1 และ "ภายใน" - สำหรับระยะที่ 2)

การตรวจจับผลิตภัณฑ์ขยายเสียง
ในเทคนิคส่วนใหญ่ ในขั้นตอนนี้ ส่วนผสมของผลิตภัณฑ์แอมพลิฟายเออร์ที่ได้จากขั้นตอนที่ 2 จะถูกคั่นด้วยอิเล็กโตรโฟรีซิสเจลแนวนอน ก่อนการแยกอิเล็กโตรโฟเรติก สารละลายเอทิเดียมโบรไมด์จะถูกเติมลงในส่วนผสมของแอมพลิฟายเออร์ ซึ่งก่อให้เกิดรอยต่อคั่นระหว่างหน้าที่แข็งแกร่งพร้อมชิ้นส่วนดีเอ็นเอแบบเกลียวคู่ สารประกอบเหล่านี้ภายใต้การกระทำของการฉายรังสี UV สามารถเรืองแสงได้ ซึ่งบันทึกเป็นแถบเรืองแสงสีส้มแดงหลังจากแยกอิเล็กโตรโฟเรติกของส่วนผสมแอมพลิฟายเออร์ในเจลอากาโรส

เป็นทางเลือกแทนวิธีการตรวจหาอิเล็กโตรโฟเรติกซึ่งมีข้อเสียอยู่บ้าง: อัตวิสัยในการอ่านผลลัพธ์ ข้อจำกัดในการกำหนดดีเอ็นเอของจุลินทรีย์ต่างๆ ในปฏิกิริยาเดียว สามารถเสนอได้ แผนการตรวจจับการผสมพันธุ์ในรูปแบบเหล่านี้ ชิ้นส่วนดีเอ็นเอที่เกิดจากการขยายพันธุ์ไฮบริไดซ์ (รูปแบบสารเชิงซ้อน 2 สาย - "ลูกผสม") ด้วยโพรบโอลิโกนิวคลีโอไทด์จำเพาะ การลงทะเบียนของคอมเพล็กซ์ดังกล่าวสามารถทำได้ในสีหรือฟลูออไรด์ SPC "Litekh" สร้างชุดตรวจจับตามการผสมพันธุ์ด้วยการลงทะเบียนผลลัพธ์ด้วยฟลูออไรเมตริก

ข้อดีของวิธี PCR เป็นวิธีการวินิจฉัยโรคติดเชื้อ:

- การตรวจหาเชื้อโรคโดยตรง

วิธีการวินิจฉัยแบบดั้งเดิมหลายวิธี เช่น การทดสอบอิมมูโนดูดซับที่เชื่อมโยงกับเอนไซม์ จะตรวจหาโปรตีนเครื่องหมายที่เป็นของเสียของสารติดเชื้อ ซึ่งให้หลักฐานทางอ้อมว่ามีการติดเชื้อเท่านั้น การระบุบริเวณ DNA เฉพาะของเชื้อโรคโดย PCR เป็นการบ่งชี้โดยตรงว่ามีเชื้อที่ติดเชื้อ

- ความจำเพาะสูง
ความจำเพาะสูงของวิธี PCR เกิดจากการตรวจพบลักษณะเฉพาะของชิ้นส่วน DNA เฉพาะสำหรับเชื้อโรคนี้เท่านั้นในวัสดุทดสอบ ความจำเพาะถูกกำหนดโดยลำดับนิวคลีโอไทด์ของไพรเมอร์ ซึ่งไม่รวม
ความเป็นไปได้ที่จะได้ผลลัพธ์ที่ผิดพลาด ตรงกันข้ามกับวิธีเอนไซม์อิมมูโนแอสเซย์ ซึ่งข้อผิดพลาดไม่ใช่เรื่องแปลกเนื่องจากแอนติเจนที่ทำปฏิกิริยาข้าม

- ความไวสูง
วิธี PCR ช่วยให้คุณตรวจจับแบคทีเรียหรือไวรัสได้แม้แต่เซลล์เดียว การวินิจฉัย PCR ตรวจพบการปรากฏตัวของเชื้อโรคของโรคติดเชื้อในกรณีที่วิธีการอื่น (ภูมิคุ้มกัน, แบคทีเรีย,
ด้วยกล้องจุลทรรศน์) เป็นไปไม่ได้ ความไวของการวิเคราะห์ PCR คือ 10-1000 เซลล์ต่อตัวอย่าง (ความไวของการทดสอบทางภูมิคุ้มกันและด้วยกล้องจุลทรรศน์คือ 103-105 เซลล์)

-ความเป็นสากลของขั้นตอนในการระบุเชื้อโรคต่างๆ
วัสดุสำหรับการศึกษาโดย PCR คือ DNA ของเชื้อโรค วิธีการนี้ขึ้นอยู่กับการตรวจจับชิ้นส่วน DNA หรือ RNA ที่เฉพาะเจาะจงสำหรับสิ่งมีชีวิตโดยเฉพาะ ความเหมือน องค์ประกอบทางเคมีของกรดนิวคลีอิกทั้งหมดช่วยให้สามารถใช้วิธีการแบบครบวงจรสำหรับการวิจัยในห้องปฏิบัติการ ทำให้สามารถวินิจฉัยเชื้อโรคหลายชนิดจากการตรวจทางชีวภาพเพียงครั้งเดียว สารคัดหลั่งทางชีวภาพต่างๆ (เมือก, ปัสสาวะ, เสมหะ), เศษเซลล์เยื่อบุผิว, เลือด, ซีรั่มสามารถใช้เป็นวัสดุทดสอบ

- ความเร็วสูงในการรับผลการวิเคราะห์
การวิเคราะห์ PCR ไม่ต้องการการแยกและการเพาะเลี้ยงเชื้อก่อโรค ซึ่งใช้เวลานาน วิธีการแบบครบวงจรสำหรับการประมวลผลวัสดุชีวภาพและการตรวจจับผลิตภัณฑ์ปฏิกิริยา และระบบอัตโนมัติของกระบวนการขยายทำให้สามารถดำเนินการวิเคราะห์ได้อย่างสมบูรณ์ใน 4-4.5 ชั่วโมง

ควรสังเกตว่าวิธี PCR สามารถตรวจจับเชื้อโรคได้ไม่เพียง แต่ในวัสดุทางคลินิกที่ได้รับจากผู้ป่วยเท่านั้น แต่ยังรวมถึงวัสดุที่ได้จากวัตถุด้วย สภาพแวดล้อมภายนอก(น้ำ ดิน ฯลฯ)

การประยุกต์ใช้วิธี PCR ในการดูแลสุขภาพภาคปฏิบัติ

การใช้วิธี PCR ในการวินิจฉัยโรคติดเชื้อทั้งจากธรรมชาติของแบคทีเรียและไวรัสมีความสำคัญอย่างยิ่งในการแก้ปัญหาทางจุลชีววิทยาและระบาดวิทยาหลายประการ การใช้วิธีนี้ยังมีส่วนช่วยในการพัฒนา การวิจัยขั้นพื้นฐานในด้านโรคติดเชื้อเรื้อรังและโรคที่ไม่ได้รับการศึกษา

การใช้วิธีการที่มีประสิทธิภาพและสมเหตุสมผลที่สุดใน:

ฝึกระบบทางเดินปัสสาวะ- เพื่อตรวจหาหนองในเทียม, ยูเรียพลาสโมซิส, โรคหนองใน, เริม, โรคการ์ดเนอร์เรลโลซิส, การติดเชื้อมัยโคพลาสมา;

ในโรคปอด- สำหรับ การวินิจฉัยแยกโรคโรคปอดบวมจากไวรัสและแบคทีเรีย, วัณโรค;

ในระบบทางเดินอาหาร- เพื่อตรวจหาเชื้อเฮลิโคแบคทีเรีย

ในคลินิกโรคติดเชื้อ- เป็นวิธีการด่วนในการวินิจฉัยโรค Salmonellosis, โรคคอตีบ, ไวรัส ไวรัสตับอักเสบบี Cและจี;

ในโลหิตวิทยา- เพื่อตรวจหาการติดเชื้อ cytomegalovirus, oncoviruses

ท้ายบทความ ดู
ปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรส (PCR, PCR)คิดค้นในปี 1983 โดย Carey Mullis (นักวิทยาศาสตร์ชาวอเมริกัน) ต่อจากนั้นเขาได้รับรางวัลโนเบลสำหรับการประดิษฐ์นี้ ปัจจุบันการวินิจฉัย PCR เป็นหนึ่งในวิธีการวินิจฉัยโรคติดเชื้อที่แม่นยำและละเอียดอ่อนที่สุด
ปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรส (PCR)- วิธีการทดลองทางอณูชีววิทยา วิธีการเพิ่มความเข้มข้นเล็กน้อยของเศษกรดนิวคลีอิก (DNA) ในวัสดุชีวภาพ (ตัวอย่าง) อย่างมีนัยสำคัญ
วิธี PCR ขึ้นอยู่กับการเพิ่มสองเท่าของ DNA บางส่วนซ้ำ ๆ ด้วยความช่วยเหลือของเอนไซม์ภายใต้สภาวะประดิษฐ์ (ในหลอดทดลอง) เป็นผลให้มีการสร้าง DNA ในปริมาณที่เพียงพอสำหรับการตรวจจับด้วยตา ในกรณีนี้ เฉพาะพื้นที่ที่ตรงตามเงื่อนไขที่กำหนดเท่านั้นที่จะถูกคัดลอก และเฉพาะในกรณีที่มีอยู่ในตัวอย่างที่อยู่ระหว่างการศึกษา
นอกเหนือจากการเพิ่มจำนวนสำเนา DNA เพียงอย่างเดียว (กระบวนการนี้เรียกว่าการขยายเสียง) PCR ยังอนุญาตให้มีการจัดการอื่น ๆ อีกมากมายด้วยสารพันธุกรรม (การแนะนำการกลายพันธุ์ การประกบชิ้นส่วน DNA) และมีการใช้กันอย่างแพร่หลายในการปฏิบัติทางชีววิทยาและการแพทย์ เช่น เพื่อวินิจฉัยโรค (กรรมพันธุ์, การติดเชื้อ) , เพื่อสร้างความเป็นพ่อ, โคลนยีน, แนะนำการกลายพันธุ์, แยกยีนใหม่

ความจำเพาะและการใช้งาน

การทำ PCR

สำหรับ PCR ในกรณีที่ง่ายที่สุด จำเป็นต้องมีส่วนประกอบต่อไปนี้:

• แม่แบบ DNA ที่มีส่วนของ DNA ที่จะขยาย;
• ไพรเมอร์สองตัวเสริมที่ส่วนท้ายของชิ้นส่วนที่ต้องการ
• โพลีเมอเรส DNA ที่ทนความร้อน;
• ดีออกซีนิวคลีโอไทด์ไตรฟอสเฟต (A, G, C, T);
• ไอออน Mg2+ ที่จำเป็นสำหรับการทำงานของโพลีเมอเรส
• สารละลายบัฟเฟอร์.

PCR ดำเนินการในแอมพลิฟายเออร์ - อุปกรณ์ที่ให้ความเย็นและความร้อนเป็นระยะ ๆ ของหลอดทดลอง โดยปกติจะมีความแม่นยำอย่างน้อย 0.1 ° C เพื่อหลีกเลี่ยงการระเหยของส่วนผสมของปฏิกิริยา น้ำมันที่มีจุดเดือดสูง เช่น วาสลีน จะถูกเติมลงในหลอดทดลอง การเติมเอ็นไซม์จำเพาะสามารถเพิ่มผลผลิตของปฏิกิริยา PCR
ความคืบหน้าของปฏิกิริยา

โดยปกติเมื่อทำ PCR จะมีการดำเนินการ 20 - 35 รอบซึ่งแต่ละรอบประกอบด้วยสามขั้นตอน แม่แบบ DNA แบบสายคู่ถูกให้ความร้อนที่อุณหภูมิ 94 - 96°C (หรือ 98°C หากใช้โพลีเมอเรสที่ทนความร้อนเป็นพิเศษ) เป็นเวลา 0.5 - 2 นาทีเพื่อให้สาย DNA แยกออกจากกัน ขั้นตอนนี้เรียกว่า denaturation - พันธะไฮโดรเจนระหว่างสองสายจะถูกทำลาย บางครั้ง ก่อนรอบแรก ส่วนผสมของปฏิกิริยาจะถูกอุ่นไว้ล่วงหน้า 2-5 นาทีเพื่อทำให้แม่แบบและสีรองพื้นแตกตัวอย่างสมบูรณ์
เมื่อเส้นใยแยกออกจากกัน อุณหภูมิจะลดลงเพื่อให้ไพรเมอร์จับกับแม่แบบที่เป็นเกลียวเดี่ยว ขั้นตอนนี้เรียกว่าการหลอม อุณหภูมิการหลอมขึ้นอยู่กับไพรเมอร์ และมักจะเลือกที่อุณหภูมิต่ำกว่าจุดหลอมเหลว 4 - 5°C เวลาแสดง - 0.5 - 2 นาที

DNA polymerase จำลองสายแม่แบบโดยใช้ไพรเมอร์เป็นไพรเมอร์ นี่คือระยะการยืดตัว อุณหภูมิการยืดตัวขึ้นอยู่กับพอลิเมอเรส พอลิเมอเรสที่ใช้บ่อยจะมีปฏิกิริยามากที่สุดที่อุณหภูมิ 72°C เวลาการยืดตัวขึ้นกับทั้งชนิดของ DNA polymerase และความยาวของชิ้นส่วนที่จะขยาย โดยปกติ เวลาการยืดตัวจะอยู่ที่หนึ่งนาทีต่อคู่เบสทุกๆ พันคู่ หลังจากสิ้นสุดรอบทั้งหมด มักจะมีขั้นตอนเพิ่มเติมของการยืดตัวสุดท้ายเพื่อให้ชิ้นส่วนที่เป็นเกลียวเดี่ยวทั้งหมดสมบูรณ์ ขั้นตอนนี้ใช้เวลา 10 - 15 นาที
การเตรียมวัสดุสำหรับการวิจัยและการขนส่งไปยังห้องปฏิบัติการ

เพื่อการวิเคราะห์ที่ประสบความสำเร็จ การรวบรวมวัสดุจากผู้ป่วยอย่างถูกต้องและเตรียมอย่างเหมาะสมเป็นสิ่งสำคัญ เป็นที่ทราบกันดีว่าในการวินิจฉัยทางห้องปฏิบัติการ ข้อผิดพลาดส่วนใหญ่ (มากถึง 70%) เกิดขึ้นในขั้นตอนการเตรียมตัวอย่าง ในการถ่ายเลือดในห้องปฏิบัติการ INVITRO ปัจจุบันใช้ระบบสูญญากาศซึ่งในอีกด้านหนึ่งทำให้ผู้ป่วยบาดเจ็บน้อยที่สุดและในทางกลับกันอนุญาตให้นำวัสดุไปในลักษณะที่ไม่สัมผัส กับบุคลากรหรือสิ่งแวดล้อม ซึ่งจะช่วยหลีกเลี่ยงการปนเปื้อน (การปนเปื้อน) ของวัสดุและช่วยให้มั่นใจถึงความเที่ยงธรรมของการวิเคราะห์ PCR

ดีเอ็นเอ - กรดดีออกซีไรโบนิวคลีอิก - โพลีเมอร์ชีวภาพ หนึ่งในสองประเภทของกรดนิวคลีอิกที่ให้การจัดเก็บ การถ่ายทอดจากรุ่นสู่รุ่น และการนำโปรแกรมพันธุกรรมไปใช้ในการพัฒนาและการทำงานของสิ่งมีชีวิต บทบาทหลักของ DNA ในเซลล์คือการจัดเก็บข้อมูลระยะยาวเกี่ยวกับโครงสร้างของ RNA และโปรตีน

กรดอาร์เอ็นเอ-ไรโบนิวคลีอิกเป็นพอลิเมอร์ชีวภาพ คล้ายคลึงกันในตัวของมัน โครงสร้างทางเคมีสู่ดีเอ็นเอ โมเลกุลอาร์เอ็นเอถูกสร้างขึ้นจากหน่วยโมโนเมอร์เดียวกัน - นิวคลีโอไทด์กับดีเอ็นเอ ในธรรมชาติ RNA มักมีอยู่เป็นเกลียวเดียว ในไวรัสบางชนิด RNA เป็นพาหะของข้อมูลทางพันธุกรรม ในเซลล์นั้นมีบทบาทสำคัญในการถ่ายโอนข้อมูลจาก DNA ไปยังโปรตีน RNA ถูกสังเคราะห์บนแม่แบบ DNA กระบวนการนี้เรียกว่าการถอดความ มีส่วนต่างๆ ใน ​​DNA ที่มีข้อมูลที่รับผิดชอบในการสังเคราะห์ RNA สามประเภท ซึ่งมีหน้าที่แตกต่างกันไป: messenger หรือ messenger RNA (mRNA), ribosomal (rRNA) และ transport (tRNA) RNA ทั้งสามประเภทมีส่วนร่วมในการสังเคราะห์โปรตีนไม่ทางใดก็ทางหนึ่ง อย่างไรก็ตาม ข้อมูลเกี่ยวกับการสังเคราะห์โปรตีนมีอยู่ใน mRNA เท่านั้น

นิวคลีโอไทด์เป็นหน่วยการทำซ้ำพื้นฐานในโมเลกุลของกรดนิวคลีอิก ผลิตภัณฑ์ของสารประกอบทางเคมีของเบสไนโตรเจน น้ำตาลห้าคาร์บอน (เพนโทส) และกลุ่มฟอสเฟตอย่างน้อยหนึ่งกลุ่ม นิวคลีโอไทด์ที่มีอยู่ในกรดนิวคลีอิกประกอบด้วยกลุ่มฟอสเฟตหนึ่งกลุ่ม พวกมันถูกตั้งชื่อตามฐานไนโตรเจนที่พวกมันมี - adenine (A) ที่มี adenine, guanine (G) - guanine, cytosine (C) - cytosine, thymine (T) - thymine, uracil (U) - uracil DNA ประกอบด้วยนิวคลีโอไทด์ 4 ประเภท - A, T, G, C, RNA ยังมี 4 ประเภทคือ A, U, G, C น้ำตาลในองค์ประกอบของนิวคลีโอไทด์ของ DNA ทั้งหมดคือดีออกซีไรโบส RNA คือไรโบส ในระหว่างการก่อตัวของกรดนิวคลีอิก นิวคลีโอไทด์จะก่อตัวเป็นแกนหลักน้ำตาลฟอสเฟตของโมเลกุลโดยการจับกันซึ่งด้านหนึ่งมีฐาน

ไพรเมอร์คือ DNA สั้น ๆ ที่ใช้ในการทำซ้ำแม่แบบ ไพรเมอร์แต่ละตัวประกอบเข้ากับหนึ่งในสายโซ่ของเทมเพลตแบบเกลียวคู่ โดยกำหนดกรอบจุดเริ่มต้นและจุดสิ้นสุดของบริเวณที่ขยาย

วรรณกรรม

1. Glick B. , Pasternak J. เทคโนโลยีชีวภาพระดับโมเลกุล. หลักการและการประยุกต์ใช้ ต่อ. จากอังกฤษ. - M.: Mir, 2002. - 589 p., ภาพประกอบ ISBN 5-03-003328-9
2. Shchelkunov S.N. พันธุวิศวกรรม - โนโวซีบีสค์: Sib. ม. สำนักพิมพ์ 2547. - 496 น.; ป่วย. ISBN 5-94087-098-8
3. Patrushev L.I. ระบบพันธุกรรมประดิษฐ์ - M.: Nauka, 2005 - ใน 2 เล่ม - ISBN 5-02-033278-X

สำคัญ!

ข้อมูลในส่วนนี้ไม่ควรใช้สำหรับการวินิจฉัยตนเองหรือการรักษาตนเอง ในกรณีที่มีอาการปวดหรืออาการกำเริบอื่น ๆ เฉพาะแพทย์ที่เข้าร่วมเท่านั้นควรกำหนดให้มีการตรวจวินิจฉัย เพื่อการวินิจฉัยและการรักษาที่เหมาะสม คุณควรติดต่อแพทย์ของคุณ

ปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรส (PCR)

สาระสำคัญของวิธี PCR ดีเอ็นเอโพลีเมอเรส

ปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรสเป็นวิธีการทดลองทางอณูชีววิทยาที่ช่วยให้เกิดการเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญในความเข้มข้นเล็กน้อยของเศษกรดนิวคลีอิกบางอย่างในวัสดุชีวภาพ กระบวนการเพิ่มจำนวนสำเนา DNA นี้เรียกว่า เครื่องขยายเสียง. การคัดลอก DNA ระหว่าง PCR นั้นดำเนินการโดยเอนไซม์พิเศษ - พอลิเมอเรส DNA polymerase (รูปที่ 3) เป็นเอนไซม์ที่เกี่ยวข้องกับการจำลองแบบ (การขยาย DNA ในสิ่งมีชีวิต) ของ DNA เอนไซม์ในกลุ่มนี้กระตุ้นการเกิดพอลิเมอไรเซชันของดีออกซีไรโบนิวคลีโอไทด์ตามสายโซ่นิวคลีโอไทด์ของดีเอ็นเอ ซึ่งเอนไซม์ "อ่าน" และใช้เป็นแม่แบบ ประเภทของนิวคลีโอไทด์ใหม่ถูกกำหนดโดยหลักการเสริมด้วยเทมเพลตที่ใช้อ่าน

DNA polymerase จะเพิ่มนิวคลีโอไทด์อิสระที่ส่วนท้าย 3 "ของห่วงโซ่ที่ประกอบเข้าด้วยกัน ซึ่งนำไปสู่การยืดตัวของสายโซ่ไปในทิศทาง 5"-3 ไม่มี DNA polymerase ใดที่รู้จักสามารถสร้างสายโซ่ "ตั้งแต่เริ่มต้น" ได้: พวกมันคือ สามารถเพิ่มนิวคลีโอไทด์ให้กับหมู่ 3"-ไฮดรอกซิลที่มีอยู่แล้วเท่านั้น ด้วยเหตุนี้ DNA polymerase จึงจำเป็น ไพรเมอร์- ลำดับนิวคลีโอไทด์สั้น ๆ (โดยปกติคือ 20-25) ประกอบกับส่วนปลายของยีนที่กำลังศึกษา - ซึ่งเธอสามารถเพิ่มนิวคลีโอไทด์แรกได้ ไพรเมอร์ประกอบด้วยเบส DNA และ RNA เสมอ โดยสองเบสแรกจะเป็นเบส RNA เสมอ ไพรเมอร์ถูกสังเคราะห์โดยเอ็นไซม์อื่น - พรีเมส. เอนไซม์อีกตัวหนึ่งคือ เฮลิเคส- จำเป็นสำหรับการคลายเกลียวคู่ของ DNA ด้วยการก่อตัวของโครงสร้างแบบเกลียวเดียว ซึ่งช่วยให้มั่นใจได้ว่าการจำลองแบบของทั้งสองเกลียวนั้นสอดคล้องกับแบบจำลองกึ่งอนุรักษ์นิยมของการจำลองดีเอ็นเอ

โพลีเมอเรส DNA บางตัวยังมีความสามารถในการแก้ไขข้อผิดพลาดในสาย DNA ที่ประกอบขึ้นใหม่ หากตรวจพบคู่ของนิวคลีโอไทด์ที่ไม่ถูกต้อง DNA พอลิเมอเรสจะย้อนกลับหนึ่งขั้นตอน ขจัดนิวคลีโอไทด์ที่ไม่ถูกต้องออกจากสายโซ่ จากนั้นจึงใส่นิวคลีโอไทด์ที่ถูกต้องเข้าที่ จากนั้นการจำลองจะดำเนินต่อไปตามปกติ

การทำ PCR

ปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรส (PCR) เป็นวิธีการขยายดีเอ็นเอที่สามารถแยกและคูณลำดับดีเอ็นเอจำเพาะได้หลายพันล้านครั้งภายในเวลาไม่กี่ชั่วโมง ความสามารถในการรับสำเนาจำนวนมากของภูมิภาคที่กำหนดไว้อย่างเข้มงวดของจีโนมทำให้การศึกษาตัวอย่างดีเอ็นเอที่มีอยู่ง่ายขึ้นอย่างมาก

เพื่อให้เกิดปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรส ต้องปฏิบัติตามเงื่อนไขหลายประการ สำหรับ PCR ในกรณีที่ง่ายที่สุด จำเป็นต้องมีส่วนประกอบต่อไปนี้:

เทมเพลต DNA ที่มีส่วนของ DNA ที่จะขยาย

ไพรเมอร์สองตัวเสริมที่ส่วนปลายของชิ้นส่วนที่ต้องการ (โอลิโกนิวคลีโอไทด์ที่สังเคราะห์ขึ้นคู่หนึ่ง ซึ่งปกติจะมีขนาด 15 ถึง 30 bp ซึ่งเหมือนกันกับบริเวณที่สอดคล้องกันของ DNA เป้าหมาย พวกมันมีบทบาทสำคัญในการก่อตัวของผลิตภัณฑ์จากปฏิกิริยาการขยายเสียง ไพรเมอร์ที่คัดเลือกมาอย่างเหมาะสมช่วยให้มั่นใจในความจำเพาะและความไวของการทดสอบ ระบบ.)

DNA polymerase ที่ทนความร้อนได้ พอลิเมอเรสที่ใช้ใน PCR จะต้องยังคงทำงานอยู่ที่ อุณหภูมิสูงเป็นเวลานานจึงใช้เอนไซม์ที่แยกได้จากเทอร์โมฟิล - Thermus aquaticus (Taq-polymerase) และอื่น ๆ

ดีออกซีนิวคลีโอไทด์ ไตรฟอสเฟต (dATP, dGTP, dCTP, dTTP)

Mg 2+ ไอออนที่จำเป็นสำหรับพอลิเมอเรสในการทำงาน

สารละลายบัฟเฟอร์ที่ให้สภาวะปฏิกิริยาที่จำเป็น - pH, ความแรงของไอออนิกของสารละลาย ประกอบด้วยเกลือ เซรั่มอัลบูมิน

เพื่อหลีกเลี่ยงการระเหยของส่วนผสมของปฏิกิริยา น้ำมันที่มีจุดเดือดสูง เช่น วาสลีน จะถูกเติมลงในหลอดทดลอง หากใช้อุปกรณ์ที่มีฝาปิดแบบอุ่นก็ไม่จำเป็น

การเพิ่มไพโรฟอสฟาเตสสามารถเพิ่มผลผลิตของปฏิกิริยา PCR เอนไซม์นี้กระตุ้นการไฮโดรไลซิสของไพโรฟอสเฟต ซึ่งเป็นผลพลอยได้จากการเพิ่มนิวคลีโอไทด์ไตรฟอสเฟตไปยังสายดีเอ็นเอที่กำลังเติบโตไปยังออร์โธฟอสเฟต ไพโรฟอสเฟตสามารถยับยั้งปฏิกิริยา PCR

ในการคูณจำนวนสำเนาของ DNA ดั้งเดิม จำเป็นต้องมีปฏิกิริยาแบบวัฏจักร ตามกฎแล้ว แต่ละรอบ PCR ที่ทำซ้ำตามลำดับประกอบด้วยสามขั้นตอน:

1. Denaturation หรือ "การละลาย" ของ DNAแม่แบบ DNA แบบสายคู่ถูกให้ความร้อนที่อุณหภูมิ 94 - 96°C (หรือ 98°C หากใช้โพลีเมอเรสที่ทนความร้อนเป็นพิเศษ) เป็นเวลา 0.5 - 2 นาทีเพื่อให้สาย DNA แยกออกจากกัน ขั้นตอนนี้เรียกว่า denaturation เนื่องจากพันธะไฮโดรเจนระหว่าง DNA สองสายจะแตกออก บางครั้ง ก่อนรอบแรก (ก่อนเติมโพลีเมอเรส) ส่วนผสมของปฏิกิริยาจะถูกอุ่นเป็นเวลา 2–5 นาทีเพื่อทำให้แม่แบบและไพรเมอร์เปลี่ยนสภาพอย่างสมบูรณ์ แนวทางนี้เรียกว่า เริ่มร้อนช่วยลดปริมาณของผลิตภัณฑ์ปฏิกิริยาที่ไม่เฉพาะเจาะจง

2. การหลอม - การรวมไพรเมอร์กับแม่แบบ DNA. เมื่อเส้นใยแยกออกจากกัน อุณหภูมิจะค่อยๆ ลดลงเพื่อให้ไพรเมอร์จับกับแม่แบบที่เป็นเกลียวเดี่ยว อุณหภูมิในการหลอมขึ้นอยู่กับองค์ประกอบของไพรเมอร์ และมักจะเลือกที่อุณหภูมิ 50–65°C เวลาแสดง - 20-60 วินาที การเลือกอุณหภูมิการหลอมที่ไม่ถูกต้องนำไปสู่การยึดเกาะของไพรเมอร์กับแม่แบบที่ไม่ดี (ที่อุณหภูมิสูง) หรือการยึดเกาะผิดที่และลักษณะของผลิตภัณฑ์ที่ไม่เฉพาะเจาะจง (ที่อุณหภูมิต่ำ)

3. สังเคราะห์ (การยืดตัวของโซ่). DNA polymerase จำลองสายแม่แบบโดยใช้ไพรเมอร์เป็น "เมล็ดพันธุ์" พอลิเมอเรสเริ่มการสังเคราะห์ของเกลียวที่สองจากปลาย 3" ของไพรเมอร์ ซึ่งผูกกับแม่แบบและเคลื่อนไปตามแม่แบบ อุณหภูมิการยืดตัวขึ้นอยู่กับพอลิเมอเรส โพลีเมอเรส Taq และ Pfu ที่ใช้กันทั่วไปมีความกระตือรือร้นมากที่สุดที่ 72 °C. ความยาวของแฟรกเมนต์ที่จะขยาย โดยปกติจะใช้เวลาหนึ่งนาทีต่อเบสทุกๆ พันคู่ หลังจากรอบทั้งหมดเสร็จสิ้นแล้ว มักจะมีขั้นตอนเพิ่มเติม การยืดตัวสุดท้ายเพื่อให้ชิ้นส่วนที่เป็นเกลียวเดี่ยวทั้งหมดสมบูรณ์ ขั้นตอนนี้ใช้เวลา 7 - 10 นาที

ต่อจากนั้น ระยะของการเปลี่ยนสภาพ การหลอม และการยืดตัวจะทำซ้ำหลายครั้ง (30 ครั้งขึ้นไป) ในแต่ละรอบ จำนวนสำเนาที่สังเคราะห์ขึ้นของชิ้นส่วนดีเอ็นเอจะเพิ่มเป็นสองเท่า

ปฏิกิริยาทั้งหมดดำเนินการในหลอดทดลองที่แช่อยู่ในเทอร์โมสตัท การเปลี่ยนแปลงอุณหภูมิและการบำรุงรักษาจะดำเนินการโดยอัตโนมัติ

เพื่อให้เข้าใจว่าการขยายส่วนของ DNA บางส่วนเกิดขึ้นได้อย่างไรระหว่าง PCR จำเป็นต้องเข้าใจตำแหน่งของไพรเมอร์ทั้งหมดและลำดับที่เสริมกันอย่างชัดเจนในสายโซ่ที่ขยายได้ในแต่ละรอบ ในรอบแรก แต่ละสายโซ่ที่สังเคราะห์ขึ้นใหม่นั้นยาวกว่าระยะห่างจากกลุ่ม 3"-ไฮดรอกซิลของไพรเมอร์ถึงขั้วนิวคลีโอไทด์ของลำดับที่ประกอบกับไพรเมอร์ที่สองมาก โซ่ดังกล่าวเรียกว่า "แม่แบบยาว" มัน อยู่ที่การสังเคราะห์เพิ่มเติมจะเกิดขึ้น

ในรอบที่สอง DNA แบบสองสายซึ่งประกอบด้วยสายที่คล้ายคลึงกันและสังเคราะห์ขึ้นใหม่ (แม่แบบแบบยาว) จะถูกทำให้เสียสภาพอีกครั้งแล้วจึงอบอ่อนด้วยไพรเมอร์ ในระหว่างการสังเคราะห์ในรอบนี้ "เทมเพลตแบบยาว" จะถูกสังเคราะห์อีกครั้ง เช่นเดียวกับเส้นใยจำนวนหนึ่งที่มีไพรเมอร์ที่ปลายด้านหนึ่งและมีลำดับประกอบกับไพรเมอร์ที่สองที่ปลายอีกด้านหนึ่ง ("เทมเพลตแบบสั้น") ในระหว่างรอบที่สาม เฮเทอโรดูเพล็กซ์ทั้งหมดที่เกิดขึ้นก่อนหน้านี้จะถูกทำให้เสียสภาพและอบอ่อนไปพร้อม ๆ กันด้วยไพรเมอร์ แล้วจึงจำลองแบบ ในรอบต่อๆ มา มี "เมทริกซ์สั้น" มากขึ้นเรื่อยๆ และรอบที่ 30 จำนวนของพวกมันนั้นมากกว่าจำนวนเชนเริ่มต้นหรือ "เมทริกซ์แบบยาว" ถึง 10 6 เท่า

ปริมาณของผลิตภัณฑ์ปฏิกิริยาจำเพาะ (จำกัดโดยไพรเมอร์) ในทางทฤษฎีจะเพิ่มขึ้นตามสัดส่วนเป็น 2 n โดยที่ n คือจำนวนรอบของปฏิกิริยา อันที่จริง ประสิทธิภาพของแต่ละรอบอาจน้อยกว่า 100% ดังนั้นในความเป็นจริง:

โดยที่ P คือปริมาณของผลิตภัณฑ์ E คือประสิทธิภาพเฉลี่ยของรอบ

จำนวนของสำเนาดีเอ็นเอ "แบบยาว" ก็เพิ่มขึ้นเช่นกัน แต่ในเชิงเส้นตรง ดังนั้นชิ้นส่วนที่เฉพาะเจาะจงจึงมีอิทธิพลเหนือผลิตภัณฑ์ปฏิกิริยา การเติบโตของผลิตภัณฑ์ที่ต้องการนั้นจำกัดแบบทวีคูณด้วยปริมาณของรีเอเจนต์ การมีอยู่ของสารยับยั้ง และการก่อตัวของผลพลอยได้

PCR เป็นวิธีที่มีความไวสูง ดังนั้น หากมี DNA ในปริมาณเล็กน้อยในตัวอย่างทดสอบที่ได้รับจากส่วนผสมของปฏิกิริยาหนึ่งไปยังอีกส่วนผสมหนึ่งโดยไม่ได้ตั้งใจ ก็จะได้ผลลัพธ์ที่เป็นเท็จ ทำให้จำเป็นต้องควบคุมสารละลายและอุปกรณ์ทั้งหมดที่ใช้สำหรับ PCR อย่างระมัดระวัง

หลักการพื้นฐานของการเลือกไพรเมอร์

เมื่อสร้างระบบทดสอบ PCR หนึ่งในงานหลักคือการเลือกไพรเมอร์ที่ถูกต้องซึ่งต้องเป็นไปตามเกณฑ์หลายประการ:

1. ไพรเมอร์ต้องมีความเฉพาะเจาะจง ความสนใจเป็นพิเศษจ่ายไปที่ปลาย 3 "ของไพรเมอร์เนื่องจากมันมาจากพวกมันที่ Taq polymerase เริ่มสร้างสายโซ่ DNA เสริมให้สมบูรณ์ หากความจำเพาะไม่เพียงพอกระบวนการที่ไม่พึงประสงค์มักจะเกิดขึ้นในหลอดทดลองที่มีส่วนผสมของปฏิกิริยา กล่าวคือ การสังเคราะห์ DNA ที่ไม่จำเพาะเจาะจง (ชิ้นส่วนสั้นหรือยาว)สามารถมองเห็นได้บนอิเล็กโตรโฟรีซิสในรูปของแถบเพิ่มเติมที่หนักหรือเบา ซึ่งทำให้ยากต่อการประเมินผลลัพธ์ของปฏิกิริยา เพราะจะทำให้สับสนในสิ่งที่เฉพาะเจาะจงได้ง่าย ผลิตภัณฑ์ขยายเสียงที่มี DNA ต่างประเทศสังเคราะห์ ส่วนหนึ่งของไพรเมอร์และ dNTP ถูกใช้ไปในการสังเคราะห์ DNA ที่ไม่จำเพาะเจาะจง ซึ่งนำไปสู่การสูญเสียความรู้สึกที่สำคัญ

2. ไพรเมอร์ไม่ควรก่อตัวเป็นไดเมอร์และลูป เช่น ไม่ควรสร้างเกลียวคู่ที่เสถียรโดยการหลอมไพรเมอร์ด้วยตัวเองหรือต่อกัน

SEI HPE "สถาบันการแพทย์แห่งรัฐครัสโนยา

ตั้งชื่อตาม Yasenetsky Federal Agency for Health and Social Development »

ภาควิชาพันธุศาสตร์การแพทย์และสรีรวิทยาคลินิก IPO

หลักการสำคัญของวิธีการ

ปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรส

คู่มือระเบียบสำหรับนักเรียน 3-4 หลักสูตร

เฉพาะทางด้านการแพทย์ทั่วไป (060101) และ

ครัสโนยาสค์ - 2007

Shnaider, N. A. , Butyanov, R. A. หลักการพื้นฐานของวิธีปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรส คู่มือระเบียบวิธีการทำงานนอกหลักสูตรของนักเรียน 3-4 หลักสูตรในสาขาอายุรศาสตร์ทั่วไป (060101) และกุมารเวชศาสตร์ (060103) - ครัสโนยาสค์: สำนักพิมพ์ GOU VPO KrasGMA, 2550. - 42 น.

คู่มือระเบียบวิธีปฏิบัติตามข้อกำหนดของมาตรฐานของรัฐ (2000) อย่างเต็มที่และสะท้อนถึงประเด็นหลัก วิธีการที่ทันสมัยการวินิจฉัยโรคทางพันธุกรรมของมนุษย์ - วิธีการของปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรสวัสดุการศึกษาถูกปรับให้เข้ากับเทคโนโลยีการศึกษาโดยคำนึงถึงลักษณะเฉพาะของการฝึกอบรมใน 3-4 หลักสูตรของคณะแพทย์และกุมารเวชศาสตร์

ผู้วิจารณ์:หัวหน้าภาควิชาพันธุศาสตร์การแพทย์ สถาบันการศึกษาระดับอุดมศึกษาของรัฐ

"มหาวิทยาลัยการแพทย์แห่งรัฐโนโวซีบีร์สค์แห่งหน่วยงานของรัฐบาลกลางเพื่อการพัฒนาด้านสุขภาพและสังคม" แพทยศาสตร์บัณฑิตศาสตราจารย์;

การจำลองดีเอ็นเอ

วัตถุประสงค์ของการศึกษาวิธีนี้คือกรดดีออกซีไรโบนิวคลีอิก (DNA) DNA เป็นพาหะสากลของข้อมูลทางพันธุกรรมในทุกสิ่งมีชีวิตที่มีอยู่บนโลก (ยกเว้นจุลินทรีย์ที่มี RNA) DNA เป็นเกลียวคู่ที่บิดเป็นเกลียว แต่ละเกลียวประกอบด้วยนิวคลีโอไทด์ที่เชื่อมต่อกันเป็นอนุกรม สาย DNA มีทิศทางตรงกันข้าม: ปลาย 5' ของสายหนึ่งตรงกับปลาย 3' ของสายที่สอง คุณสมบัติที่เป็นเอกลักษณ์ของ DNA คือความสามารถในการทำซ้ำตัวเอง กระบวนการนี้เรียกว่า การจำลองแบบ. การจำลองแบบของโมเลกุล DNA เกิดขึ้นในช่วงเวลาสังเคราะห์ของเฟส แต่ละสายโซ่สองสายของโมเลกุล "แม่" ทำหน้าที่เป็นแม่แบบสำหรับ "ลูกสาว" หลังจากการทำซ้ำ โมเลกุล DNA ที่สังเคราะห์ขึ้นใหม่จะมีสาย "มารดา" หนึ่งเส้น และเส้นที่สอง - "ลูกสาว" ซึ่งถูกสังเคราะห์ขึ้นใหม่ (วิธีกึ่งอนุรักษ์นิยม) สำหรับการสังเคราะห์ต้นแบบของโมเลกุลดีเอ็นเอใหม่ จำเป็นที่โมเลกุลเก่าจะถูกขับออกและยืดออก การจำลองแบบเริ่มต้นที่ตำแหน่งต่างๆ ในโมเลกุลดีเอ็นเอ ส่วนของโมเลกุลดีเอ็นเอจากจุดเริ่มต้นของการจำลองแบบหนึ่งไปยังจุดเริ่มต้นของอีกโมเลกุลหนึ่งเรียกว่า ตัวจำลอง.

เริ่มการจำลองแบบแล้ว ไพรเมอร์(เมล็ด) ประกอบด้วยคู่เบส 100-200 คู่ เอ็นไซม์ DNA helicase คลายและแยกเกลียว DNA แม่ออกเป็นสองสายซึ่งตามหลักการของการเติมเต็มด้วยการมีส่วนร่วมของเอนไซม์ DNA polymerase จะประกอบสาย DNA "ลูกสาว" เพื่อให้เอ็นไซม์เริ่มทำงานจำเป็นต้องมีบล็อกเริ่มต้น - ชิ้นส่วนเล็ก ๆ ที่เป็นเกลียวคู่เริ่มต้น บล็อกเริ่มต้นเกิดขึ้นเมื่อไพรเมอร์มีปฏิสัมพันธ์กับบริเวณเสริมของเกลียวที่สอดคล้องกันของ DNA แม่ ในแต่ละการจำลอง DNA polymerase สามารถเคลื่อนที่ไปตามสาย "แม่" ได้เพียงทิศทางเดียว (5`=>3`)

บนเกลียวชั้นนำในขณะที่ตัวจำลองคลายเกลียว "ลูกสาว" จะค่อยๆเติบโตอย่างต่อเนื่อง เกลียวของลูกสาวยังสังเคราะห์ในทิศทาง (5`=>3`) บนเกลียวที่ล้าหลัง แต่จะแยกเป็นชิ้นเล็กชิ้นน้อยเมื่อเรพลิคอนคลายออก

ดังนั้นสิ่งที่แนบมาของนิวคลีโอไทด์เสริมของเส้น "ลูกสาว" จึงไปในทิศทางตรงกันข้าม (ตรงกันข้าม) การจำลองแบบในการจำลองทั้งหมดเกิดขึ้นพร้อมกัน ชิ้นส่วนและชิ้นส่วนของเส้น "ลูกสาว" ที่สังเคราะห์ในเรพลิคอนต่างๆ จะถูกมัดเป็นเกลียวเดียวโดยใช้เอ็นไซม์ไลกาส การจำลองแบบมีลักษณะกึ่งอนุรักษ์ ต่อต้านขนาน และไม่ต่อเนื่อง จีโนมทั้งหมดของเซลล์ถูกจำลองแบบหนึ่งครั้งต่อช่วงเวลาที่สอดคล้องกับวัฏจักรไมโทติคหนึ่งรอบ อันเป็นผลมาจากกระบวนการจำลองแบบ โมเลกุล DNA สองอันถูกสร้างขึ้นจากโมเลกุล DNA หนึ่งตัว ซึ่งสายหนึ่งมาจากโมเลกุล DNA ของแม่ และตัวที่สอง ลูกสาว ถูกสังเคราะห์ขึ้นใหม่ (รูปที่ 1)

ข้าว. หนึ่ง. แผนภาพการจำลองแบบโมเลกุลดีเอ็นเอ

ดังนั้น วงจรการจำลองแบบดีเอ็นเอประกอบด้วย สามขั้นตอนหลัก:

1. คลายเกลียวดีเอ็นเอและความแตกต่างของเกลียว (denaturation);

2. สิ่งที่แนบมาของไพรเมอร์

3. ความสมบูรณ์ของห่วงโซ่ของเธรดย่อย

หลักการของวิธี PCR

มันคือการจำลองดีเอ็นเอที่เป็นพื้นฐานของ PCR ใน PCR กระบวนการที่ระบุไว้ข้างต้นจะดำเนินการในหลอดทดลองในโหมดวัฏจักร การเปลี่ยนจากขั้นตอนหนึ่งของปฏิกิริยาไปเป็นอีกขั้นตอนหนึ่งทำได้โดยการเปลี่ยนอุณหภูมิของส่วนผสมในการฟักไข่ เมื่อสารละลายถูกทำให้ร้อนถึง 93-95 °C DNA denaturation จะเกิดขึ้น เพื่อไปยังขั้นตอนต่อไป - การเติมหรือ "หลอม" ของไพรเมอร์ - ส่วนผสมในการฟักไข่จะถูกทำให้เย็นลงที่อุณหภูมิ 50-60 องศาเซลเซียส จากนั้น ส่วนผสมจะถูกให้ความร้อนที่อุณหภูมิ 70-72°C ซึ่งเป็นการทำงานที่เหมาะสมที่สุดของ taq-DNA polymerase ในขั้นตอนนี้ สาย DNA ใหม่จะเสร็จสมบูรณ์ จากนั้นวงจรจะทำซ้ำอีกครั้ง กล่าวอีกนัยหนึ่ง วิธี PCR คือการเพิ่มจำนวนสำเนาหลายเท่า (เครื่องขยายเสียง) ส่วนเฉพาะของ DNA ที่เร่งปฏิกิริยาโดยเอนไซม์ DNA polymerase

การขยายสาย DNA ของลูกสาวจะต้องเกิดขึ้นพร้อมกันบนสาย DNA ของมารดาทั้งสองสาย ดังนั้นการจำลองแบบของสายที่สองจึงจำเป็นต้องมีไพรเมอร์ของมันเอง ดังนั้น ไพรเมอร์สองตัวจึงถูกนำมาใช้ในส่วนผสมของปฏิกิริยา: หนึ่งสำหรับ "+"-chain, ที่สองสำหรับ "-"-chain เมื่อเข้าร่วมกับสายตรงข้ามของโมเลกุลดีเอ็นเอแล้ว ไพรเมอร์จะจำกัดตัวเองไว้ที่ส่วนนั้นของมัน ซึ่งจะถูกเพิ่มเป็นสองเท่าหรือขยายซ้ำแล้วซ้ำอีก ความยาวของชิ้นส่วนดังกล่าว ซึ่งเรียกว่าแอมพลิคอน โดยปกติจะมีนิวคลีโอไทด์หลายร้อยตัว

ขั้นตอน PCR

รอบการขยายเสียงแต่ละรอบประกอบด้วย 3 ขั้นตอนที่เกิดขึ้นในสภาวะอุณหภูมิที่ต่างกัน (รูปที่ 2)

· ขั้นที่ 1:การเสื่อมสภาพของดีเอ็นเอ . มันไหลที่ 93-95 °เป็นเวลา 30-40 วินาที

· ระยะที่ 2:การหลอมไพรเมอร์ . สิ่งที่แนบมากับไพรเมอร์เกิดขึ้นพร้อมกับลำดับที่สอดคล้องกันบนสาย DNA ตรงข้ามที่ขอบเขตของภูมิภาคเฉพาะ ไพรเมอร์แต่ละคู่มีอุณหภูมิการอบอ่อนของตัวเอง โดยมีค่าอยู่ในช่วง 50-60 องศาเซลเซียส เวลาในการหลอม 20-60 วินาที

· ขั้นตอนที่ 3:การขยายสายโซ่ DNA ส่วนขยายเสริมของสายโซ่ DNA เกิดขึ้นจากปลายสาย 5 นิ้วถึงปลายสาย 3 นิ้วในทิศทางตรงกันข้ามโดยเริ่มจากจุดยึดของไพรเมอร์ วัสดุสำหรับการสังเคราะห์สายดีเอ็นเอใหม่คือดีออกซีไรโบนิวคลีโอไซด์ ไตรฟอสเฟตที่เติมลงในสารละลาย กระบวนการสังเคราะห์ถูกเร่งโดยเอนไซม์ taq-polymerase และเกิดขึ้นที่อุณหภูมิ 70-72°C เวลาสังเคราะห์ - 20-40 วินาที

สาย DNA ใหม่ที่เกิดขึ้นในรอบการขยายสัญญาณแรกทำหน้าที่เป็นแม่แบบสำหรับรอบการขยายที่สอง ซึ่งสร้างชิ้นส่วน DNA ของแอมพลิคอนเฉพาะขึ้น (รูปที่ 3) ในรอบการขยายเสียงที่ตามมา แอมพลิคอนทำหน้าที่เป็นแม่แบบสำหรับการสังเคราะห์เชนใหม่

ดังนั้นแอมพลิคอนจึงสะสมในสารละลายตามสูตร 2" โดยที่ n คือจำนวนรอบการขยายเสียง ดังนั้น แม้ว่าจะมีโมเลกุล DNA ที่มีเกลียวคู่เพียงตัวเดียวในสารละลายเริ่มต้นในขั้นต้น โมเลกุลแอมพลิคอนประมาณ 108 โมเลกุลก็สะสมอยู่ในสารละลายใน 30-40 รอบ จำนวนนี้เพียงพอสำหรับการตรวจจับด้วยตาเปล่าที่เชื่อถือได้ของชิ้นส่วนนี้โดย agarose gel electrophoresis

กระบวนการขยายเสียงจะดำเนินการในเทอร์โมสตัทที่ตั้งโปรแกรมได้พิเศษ ( นักปั่นจักรยาน) ซึ่งตามโปรแกรมที่กำหนด อุณหภูมิจะเปลี่ยนโดยอัตโนมัติตามจำนวนรอบการขยายเสียง

ส่วนประกอบต่อไปนี้จำเป็นสำหรับการขยายสัญญาณ:

· แม่แบบดีเอ็นเอ(DNA หรือส่วนของมันมีชิ้นส่วนเฉพาะที่ต้องการ);

· ไพรเมอร์(โอลิโกนิวคลีโอไทด์สังเคราะห์ (20-30 คู่นิวคลีโอไทด์) ประกอบกับลำดับดีเอ็นเอที่ขอบเขตของชิ้นส่วนจำเพาะที่กำลังหาอยู่) การเลือกชิ้นส่วนเฉพาะและการเลือกไพรเมอร์มีบทบาทสำคัญในความจำเพาะของการขยายเสียง ซึ่งส่งผลต่อคุณภาพของการวิเคราะห์

· ส่วนผสมของดีออกซีนิวคลีโอไทด์ ไตรฟอสเฟต (dNTPs)(ส่วนผสมของ dNTP สี่ตัว ซึ่งเป็นวัสดุสำหรับการสังเคราะห์สาย DNA เสริมใหม่ที่ความเข้มข้นเทียบเท่า 200-500 ไมครอน)

· เอนไซม์ตัก-พอลิเมอเรส( DNA polymerase ที่ทนความร้อนได้ กระตุ้นการยืดของสายไพรเมอร์โดยการเพิ่มเบสของนิวคลีโอไทด์ตามลำดับไปยังสายโซ่ที่กำลังเติบโตของ DNA สังเคราะห์ 2-3 มม.)

· สารละลายบัฟเฟอร์(ตัวกลางทำปฏิกิริยาที่มี Mg2+ ไอออนที่จำเป็นต่อการรักษาการทำงานของเอนไซม์ PH 6.8-7.8)

เพื่อตรวจสอบบริเวณเฉพาะของจีโนมของไวรัสอาร์เอ็นเอ อันดับแรกได้สำเนาดีเอ็นเอจากเทมเพลตอาร์เอ็นเอโดยใช้ปฏิกิริยาการถอดรหัสแบบย้อนกลับ (RT) ที่เร่งปฏิกิริยาโดยเอ็นไซม์รีเวิร์สทรานสคริปเทส (reverse transcriptase)

ข้าว. 2. กำลังขยาย (รอบที่ 1)

ข้าว. 3. กำลังขยาย (รอบที่ 2)

การใช้งานหลักของ PCR

คลินิกเวชกรรม:

o การวินิจฉัยการติดเชื้อ

o การตรวจหาการกลายพันธุ์ รวมถึงการวินิจฉัยโรคทางพันธุกรรม

o genotyping รวมทั้ง HLA genotyping

o เทคโนโลยีเซลลูลาร์

นิเวศวิทยา (เป็นวิธีการตรวจสอบสถานะและคุณภาพของวัตถุ สิ่งแวดล้อมและอาหาร)

คำจำกัดความของสิ่งมีชีวิตดัดแปลงพันธุกรรม (GMOs)

บัตรประจำตัวส่วนบุคคล, ความเป็นพ่อ, นิติเวช

ชีววิทยาทั่วไปและเฉพาะ

หลักการพื้นฐาน

องค์กรของห้องปฏิบัติการวินิจฉัย

การทำงานในห้องปฏิบัติการ PCR ดำเนินการตาม "กฎสำหรับการออกแบบ ความปลอดภัย สุขาภิบาลอุตสาหกรรม ระบบป้องกันโรคระบาด และสุขอนามัยส่วนบุคคลเมื่อทำงานในห้องปฏิบัติการ (แผนก, แผนก) ของสถาบันสุขาภิบาลและระบาดวิทยาของระบบการดูแลสุขภาพ

การปนเปื้อนของตัวอย่างดีเอ็นเอ

การดำเนินการวินิจฉัย PCR นั้นเกี่ยวข้องกับปัญหาที่เกิดจากความไวสูงของวิธีการ - ความเป็นไปได้ การปนเปื้อน. หากปริมาณ DNA ที่เป็นบวกจำนวนตามรอยเข้าสู่หลอดปฏิกิริยา (ผลิตภัณฑ์ขยาย DNA เฉพาะ - แอมพลิคอน; มาตรฐาน DNA ที่ใช้เป็นตัวควบคุมเชิงบวก; DNA เชิงบวกของตัวอย่างทางคลินิก) นำไปสู่การขยายของชิ้นส่วน DNA ที่เฉพาะเจาะจงระหว่าง PCR และเป็นผลให้ การปรากฏตัวของผลลัพธ์ที่เป็นเท็จ

ในระหว่างการทำงานคุณอาจพบกับ การปนเปื้อนสองประเภท:

1. การปนเปื้อนข้ามจากตัวอย่างหนึ่งไปยังอีกตัวอย่างหนึ่ง (ระหว่างการประมวลผลของตัวอย่างทางคลินิกหรือเมื่อขุดส่วนผสมของปฏิกิริยาออก) นำไปสู่การปรากฏตัวของผลบวกที่ผิดพลาดเป็นระยะ ๆ

2. การขยายการปนเปื้อนของผลิตภัณฑ์(amplicons) มี มูลค่าสูงสุดเนื่องจากในระหว่างกระบวนการ PCR แอมพลิคอนจะสะสมในปริมาณมาก และเป็นผลิตภัณฑ์ในอุดมคติสำหรับการขยายสัญญาณซ้ำ

ติดตามการปนเปื้อนของแอมพลิคอนในจาน ปิเปตอัตโนมัติและอุปกรณ์ห้องปฏิบัติการ พื้นผิวของโต๊ะในห้องปฏิบัติการ หรือแม้แต่พื้นผิวของผิวหนังของผู้ปฏิบัติงานในห้องปฏิบัติการจะทำให้เกิดผลบวกที่ผิดพลาดอย่างเป็นระบบ การระบุแหล่งที่มาของการปนเปื้อนอาจเป็นเรื่องยากมากและต้องใช้เวลาและเงินเป็นจำนวนมาก ประสบการณ์ที่สั่งสมมาจนถึงปัจจุบันในการทำงานของห้องปฏิบัติการโดยใช้วิธี PCR สำหรับการวินิจฉัยช่วยให้เราสามารถกำหนดข้อกำหนดพื้นฐานสำหรับองค์กรของห้องปฏิบัติการดังกล่าวและดำเนินการวิเคราะห์ด้วยตนเอง การปฏิบัติตามข้อกำหนดเหล่านี้ช่วยขจัดความเป็นไปได้ของการปนเปื้อนและได้ผลลัพธ์ที่เป็นเท็จ

ขั้นตอนของการวิเคราะห์ PCR

แยกตามภูมิศาสตร์โดยวางไว้ในห้องแยกกัน (รูปที่ 4.5):

· ห้องเตรียม PCR,ในกรณีที่ดำเนินการกับตัวอย่างทางคลินิก การแยกดีเอ็นเอ การเตรียมส่วนผสมของปฏิกิริยาสำหรับ PCR และ PCR (หากมีเงื่อนไข ขอแนะนำให้ดำเนินการสองขั้นตอนสุดท้ายในห้องแยกเพิ่มเติม) ในห้องเหล่านี้ห้ามมิให้ทำงานประเภทอื่นทั้งหมดกับตัวแทนที่ทำการศึกษาซึ่งจะทำการวินิจฉัย PCR ในห้องปฏิบัติการนี้

· ห้องโพสต์ PCR,ที่ทำการตรวจจับผลิตภัณฑ์ขยายสัญญาณ อาจใช้วิธีการตรวจจับอื่นในห้องนี้ ขอแนะนำให้หาห้องสำหรับตรวจจับผลิตภัณฑ์ขยายสัญญาณให้ไกลที่สุดจากห้องก่อน PCR

ห้องทำงานมีหลอดอัลตราไวโอเลตที่มีรังสีสูงสุดในพื้นที่ 260 นาโนเมตร (ประเภท DB-60) ในอัตรา 2.5 W ต่อ 1 m3 หลอดไฟถูกจัดวางเพื่อให้พื้นผิวของโต๊ะทำงาน อุปกรณ์ และวัสดุที่ผู้ปฏิบัติงานสัมผัสกันระหว่างการวิเคราะห์ PCR จะได้รับรังสีโดยตรง การฉายรังสีจะดำเนินการภายใน 1 ชั่วโมงก่อนเริ่มงานและภายใน 1 ชั่วโมงหลังจากสิ้นสุดการทำงาน

แพทย์ในห้องปฏิบัติการทำงานในชุดห้องปฏิบัติการพิเศษ ซึ่งจะเปลี่ยนไปเมื่อย้ายจากห้องหนึ่งไปยังอีกห้องหนึ่ง และสวมถุงมือแบบใช้แล้วทิ้ง มีการแปรรูปเสื้อผ้าจากห้องต่างๆ แยกกัน พนักงานต่างทำงานในขั้นตอนต่าง ๆ ของการวิเคราะห์ PCR

สำหรับงาน ใช้ชุดจ่ายยา พลาสติกและเครื่องแก้ว อุปกรณ์ห้องปฏิบัติการ ชุดคลุม และถุงมือแยกต่างหาก ซึ่งออกแบบมาสำหรับขั้นตอนการวิเคราะห์ต่างๆ และไม่สามารถถ่ายโอนจากห้องหนึ่งไปยังอีกห้องหนึ่งได้ มีการติดฉลากอุปกรณ์ วัสดุ และสินค้าคงคลังในแต่ละห้องให้สอดคล้องกัน

ทุกขั้นตอนของการทำงานดำเนินการโดยใช้วัสดุสิ้นเปลืองแบบใช้แล้วทิ้งเท่านั้น: เคล็ดลับสำหรับปิเปตอัตโนมัติ หลอดทดลอง ถุงมือ ฯลฯ อย่าลืมเปลี่ยนทิปเมื่อย้ายจากตัวอย่างหนึ่งไปยังอีกตัวอย่างหนึ่ง จำเป็นต้องใช้เคล็ดลับที่มีตัวกรองกั้นละอองลอยเพื่อป้องกันไม่ให้ไมโครดรอปเล็ตของสารละลายเข้าสู่ปิเปต หลอดทดลองและทิปที่ใช้แล้วจะถูกทิ้งในภาชนะพิเศษหรือภาชนะที่มีน้ำยาฆ่าเชื้อ ตัวอย่างทางคลินิกถูกจัดเก็บแยกจากรีเอเจนต์

สำหรับการแปรรูปและทำความสะอาดสถานที่ทำงาน แต่ละห้องมีสำลีพันสำลี (ผ้าเช็ดปาก) แหนบ น้ำยาฆ่าเชื้อ และน้ำยาฆ่าเชื้อ

ในห้องปฏิบัติการวินิจฉัย PCR ไม่รวมงานที่เกี่ยวข้องกับการผลิต (การโคลนนิ่ง) และการแยกพลาสมิดลูกผสมที่มีลำดับดีเอ็นเอหรือชิ้นส่วนยีนของเชื้อโรคที่ได้รับการวินิจฉัยในห้องปฏิบัติการนี้

การรวบรวมวัสดุทางคลินิก

วัสดุที่ศึกษาสำหรับ PCR สามารถขูดเซลล์เยื่อบุผิว เลือด พลาสมา ซีรั่ม น้ำเยื่อหุ้มปอดและไขสันหลัง ปัสสาวะ เสมหะ เมือก และสารคัดหลั่งทางชีวภาพอื่นๆ ตัวอย่างชิ้นเนื้อ

การสุ่มตัวอย่างวัสดุจะดำเนินการในสภาวะของห้องบำบัดของโปรไฟล์ที่เกี่ยวข้อง หลังจากการสุ่มตัวอย่าง ควรนำตัวอย่างไปที่ห้องปฏิบัติการวินิจฉัย PCR โดยเร็วที่สุด

การสุ่มตัวอย่างต้องดำเนินการโดยใช้เครื่องมือปลอดเชื้อ ควรใช้แล้วทิ้ง เฉพาะในหลอดพลาสติกหรือหลอดแก้วที่ปลอดเชื้อแบบใช้แล้วทิ้ง ผ่านการบำบัดล่วงหน้าเป็นเวลาหนึ่งชั่วโมงด้วยส่วนผสมของโครเมียม ล้างให้สะอาดด้วยน้ำกลั่นและเผาในเตาอบที่อุณหภูมิ 150 ° C เป็นเวลา 1 ชั่วโมง

โซนตรวจจับ (ชั้นอื่นหรืออาคารอื่น)

ข้าว. 4. อุปกรณ์ห้องปฏิบัติการ PCR พร้อมการตรวจจับด้วยอิเล็กโตรโฟรีซิส

โซนตรวจจับ (ชั้นหรืออาคารต่างกัน)

ข้าว. 5. อุปกรณ์ห้องปฏิบัติการ PCR พร้อมการตรวจจับเรืองแสง (การวิเคราะห์เชิงปริมาณ)

ข้าว. 6. ห้องสกัดดีเอ็นเอแสดงให้เห็นเป็นกล่องบนโต๊ะที่มีโคมไฟฆ่าเชื้อแบคทีเรีย

ข้าว. 7. ห้องขยายเสียง

ข้าว. แปด. ห้องตรวจ.

ข้าว. 9. ตัวอย่างเลือดสำหรับการตรวจ DNA ของโรคทางพันธุกรรม.

การจัดเก็บและขนส่งตัวอย่าง

สำหรับการวินิจฉัยโรคทางพันธุกรรม ตัวอย่างเลือดจะถูกเก็บไว้ในรูปแบบกระดาษพิเศษหรือในเอปินดอร์ฟ (หลอดทดลองพลาสติก) ในสถานะแช่แข็งเป็นเวลานาน (รูปที่ 9)

สำหรับการวินิจฉัยโรคติดเชื้อนั้น เก็บตัวอย่างไว้ที่อุณหภูมิห้องไม่เกิน 2 ชั่วโมง หากต้องการเก็บรักษานานขึ้น สามารถเก็บตัวอย่างไว้ในตู้เย็นที่อุณหภูมิ 2-8°C เป็นระยะเวลาไม่เกิน 24 ชั่วโมง อนุญาตให้เก็บได้นานขึ้น (สูงสุด 2 สัปดาห์) เมื่อแช่แข็งในช่องแช่แข็งที่อุณหภูมิลบ 20°C ไม่อนุญาตให้แช่แข็งตัวอย่างซ้ำๆ

หากห้องปฏิบัติการวินิจฉัย PCR และห้องขั้นตอนสำหรับการสุ่มตัวอย่างแยกจากกันตามภูมิศาสตร์ ก็ควรขนส่งตัวอย่างในกระติกน้ำร้อนหรือภาชนะเก็บความร้อนตามกฎสำหรับการจัดเก็บตัวอย่างและกฎสำหรับการขนส่งวัสดุที่ติดเชื้อ

การสกัด DNA จากตัวอย่าง

วิธีการดูดซับแบบโซลิดเฟส ซึ่งประกอบด้วยการเพิ่มสารสลายที่มีสารละลายกัวนิดีน การดูดซับดีเอ็นเอบนตัวดูดซับ การล้างซ้ำๆ และการสลายของดีเอ็นเอด้วยสารละลายบัฟเฟอร์กลายเป็นที่แพร่หลาย ในกรณีของซีรั่ม พลาสมา หรือการประมวลผลเลือดครบส่วน มักใช้วิธีการสกัดฟีนอลิก วิธีการนี้เกี่ยวข้องกับการลดโปรตีนด้วยฟีนอล/คลอโรฟอร์มตามด้วยการตกตะกอนของ DNA (หรือ RNA) ด้วยเอธานอลหรือไอโซโพรพานอล การประมวลผลดำเนินการในหลอดทดลองไมโครเซนตริฟิวจ์ประเภท Eppendor P ที่มีปริมาตร 1.5 มล. เวลาในการดำเนินการคือ 1.5-2 ชั่วโมง (รูปที่ 10)

ข้าว. 10. การแยกตัวของดีเอ็นเอ

การทำ PCR

ตัวอย่างจำนวนหนึ่งจากตัวอย่างทางคลินิกที่ผ่านกระบวนการแล้วจะถูกโอนไปยังหลอดไมโครเซนตริฟิวจ์ชนิด Eppendorf พิเศษที่มีปริมาตร 0.2 หรือ 0.5 มล. ส่วนผสมของการขยายเสียงประกอบด้วยน้ำ บัฟเฟอร์ PCR สารละลาย dNTP สารละลายไพรเมอร์ และสารละลาย หลอดเดียวกัน Taq polymerase (เติมลงในส่วนผสมสุดท้าย) โดยปกติปริมาตรของส่วนผสมของปฏิกิริยาคือ 25 µl จากนั้นเติมน้ำมันแร่หนึ่งหยดในแต่ละหลอดเพื่อป้องกันการระเหยของส่วนผสมของปฏิกิริยาในระหว่างการขยาย เทอร์โมสแตทที่ตั้งโปรแกรมได้ (แอมพลิฟายเออร์) โดยการขยายเสียงจะดำเนินการในโหมดอัตโนมัติตามโปรแกรมที่กำหนด (รูปที่ 11)

ข้าว. สิบเอ็ด เครื่องขยายเสียง " เทอร์โมไซเลอร์ ».

เวลาตอบสนองขึ้นอยู่กับโปรแกรมที่กำหนดคือ 2-3 ชั่วโมง ควบคู่ไปกับตัวอย่างทดลอง วางตัวอย่างกลุ่มควบคุม: กลุ่มควบคุมเชิงบวกรวมถึงส่วนประกอบทั้งหมดของปฏิกิริยา แต่แทนที่จะใช้วัสดุของตัวอย่างทางคลินิก จึงมีการแนะนำการเตรียม DNA ควบคุมของยีนที่อยู่ระหว่างการศึกษา กลุ่มควบคุมเชิงลบรวมถึงองค์ประกอบทั้งหมดของปฏิกิริยา แต่แทนที่จะเพิ่มวัสดุทางคลินิกหรือการเตรียม DNA จะมีการเติมน้ำปราศจากไอออนในปริมาณที่เหมาะสมหรือสารสกัดที่ไม่มี DNA ที่ศึกษา จำเป็นต้องมีการควบคุมเชิงลบเพื่อตรวจสอบส่วนประกอบของปฏิกิริยาว่าไม่มี DNA อยู่ในนั้นเนื่องจากการปนเปื้อนและเพื่อแยกผลลัพธ์ที่เป็นเท็จออก

การลงทะเบียนของผลลัพธ์

ตรวจพบชิ้นส่วน DNA ที่จำเพาะเจาะจงโดย agarose gel electrophoresis ต่อหน้าเอธิเดียมโบรไมด์ เอทิเดียม โบรไมด์สร้างสารประกอบคั่นระหว่างหน้าที่มีเศษ DNA ซึ่งจะปรากฏเป็นแถบเรืองแสงเมื่อเจลถูกฉายรังสี UV ที่ความยาวคลื่น 290-330 นาโนเมตร ขึ้นอยู่กับขนาดของแอมพลิคอน PCR ที่เกิดขึ้น เจลที่มีอะกาโรส 1.5% ถึง 2.5% จะถูกใช้ ในการเตรียมเจล agarose จะมีการละลายส่วนผสมของ agarose บัฟเฟอร์และน้ำในเตาอบไมโครเวฟหรือในอ่างน้ำและเติมสารละลายเอทิเดียมโบรไมด์ เมื่อเย็นลงที่อุณหภูมิ 50-60 องศาเซลเซียส ส่วนผสมจะถูกเทลงในแม่พิมพ์ที่มีความหนา 4-6 มม. และใช้หวีพิเศษทำกระเป๋าในเจลสำหรับใส่ตัวอย่าง หวีถูกตั้งค่าเพื่อให้ระหว่างด้านล่างของหลุมและฐานของเจลยังคงเป็นชั้นของ agarose 0.5-1 มม. หลังจากที่เจลแข็งตัวแล้ว แอมพลิฟายเออร์จะถูกนำไปใช้กับกระเป๋าในปริมาณ 5-15 ไมโครลิตร ขอแนะนำให้ดำเนินการอิเล็กโตรโฟรีซิสของส่วนผสมของเครื่องหมายความยาวชิ้นส่วนดีเอ็นเอควบคู่ไปกับกลุ่มควบคุมและตัวอย่างทดลอง โดยปกติ ของผสมดังกล่าวประกอบด้วยชิ้นส่วนดีเอ็นเอสิบชิ้น 100, 200, 300 เป็นต้น คู่เบสยาว

การตั้งค่าตัวอย่างดังกล่าวทำให้คุณสามารถตรวจสอบความยาวของแอมพลิคอนในตัวอย่างกลุ่มควบคุมและตัวอย่างทดลองได้ เจลที่มีตัวอย่างที่ใช้จะถูกถ่ายโอนไปยังห้องอิเล็กโตรโฟรีซิสที่เต็มไปด้วยบัฟเฟอร์ ห้องนั้นเชื่อมต่อกับแหล่งพลังงาน และการแยกอิเล็กโตรโฟรีติกของผลิตภัณฑ์การขยายเสียงจะดำเนินการเป็นเวลา 30-45 นาทีที่ความแรงของสนามไฟฟ้า 10-15 วี/ซม. ในกรณีนี้ ด้านหน้าของสีย้อมซึ่งเป็นส่วนหนึ่งของส่วนผสมของปฏิกิริยาจะต้องผ่านอย่างน้อย 3 ซม.

หลังจากสิ้นสุดอิเล็กโตรโฟรีซิส เจลจะถูกถ่ายโอนไปยังแก้วทรานซิลูมิเนเตอร์และมองในแสงอัลตราไวโอเลต สำหรับเอกสารประกอบ เจลจะถูกถ่ายภาพด้วยฟิล์ม Mikrat 300 หรือบันทึกโดยใช้ระบบวิดีโอที่เชื่อมต่อกับคอมพิวเตอร์

ตัวอย่างกลุ่มควบคุมจะได้รับการประเมินก่อน ในเลนอิเล็กโทรโฟเรติกที่สอดคล้องกับการควบคุมเชิงบวก ควรมีแถบเรืองแสงสีส้มอยู่ การเคลื่อนที่แบบอิเล็กโตรโฟรีติกควรสอดคล้องกับความยาวของแอมพลิคอนที่ระบุในคำแนะนำ

ในแทร็กอิเล็กโตรโฟรีติกที่สอดคล้องกับการควบคุมเชิงลบ แถบดังกล่าวควรหายไป การมีอยู่ของแถบดังกล่าวในกลุ่มควบคุมเชิงลบบ่งชี้ว่ามีการปนเปื้อน - การปนเปื้อนของรีเอเจนต์ที่ใช้กับ DNA หรือแอมพลิคอนที่ศึกษา ตัวอย่างทดสอบจะถูกประเมินโดยการมีอยู่ของแถบในเลนที่สอดคล้องกันซึ่งอยู่ที่ระดับเดียวกับแถบในตัวอย่างกลุ่มควบคุมเชิงบวก ความเข้มของแถบเรืองแสงสอดคล้องกับปริมาณของ DNA ที่ศึกษาในกลุ่มตัวอย่าง ซึ่งช่วยให้สามารถประเมิน PCR แบบกึ่งปริมาณได้ โดยปกติผลลัพธ์ที่เป็นบวกจะได้รับการประเมินในระดับสี่จุด หากเรืองแสงของแถบในตัวอย่างทดลองอ่อนมาก ตัวอย่างดังกล่าวควรได้รับการจัดเรียงใหม่ (รูปที่ 12)

ข้าว. 12. อิเล็กโทรโฟรีซิสในเจลอากาโรส

แอปพลิเคชัน PCR สำหรับการวินิจฉัยการกลายพันธุ์ของจุดและความหลากหลายของยีน

หนึ่งในขอบเขตชั้นนำของการประยุกต์ใช้ PCR ในการดูแลสุขภาพเชิงปฏิบัติคือการวินิจฉัยการกลายพันธุ์ของจุดและความหลากหลายของยีน . มีวิธีการวินิจฉัยดีเอ็นเอโดยตรงและโดยอ้อม ในสถานการณ์ที่รู้จักยีน ความเสียหายที่นำไปสู่การพัฒนาของโรคทางพันธุกรรม ความเสียหายนี้สามารถตรวจพบได้ด้วยวิธีการทางอณูพันธุศาสตร์ วิธีการดังกล่าวเรียกว่าโดยตรง การใช้วิธีการโดยตรงจะตรวจพบการรบกวนในลำดับนิวคลีโอไทด์หลักของ DNA (การกลายพันธุ์และประเภทของพวกมัน) วิธีการโดยตรงมีลักษณะเฉพาะด้วยความแม่นยำถึงเกือบ 100%

อย่างไรก็ตาม ในทางปฏิบัติ วิธีการเหล่านี้สามารถใช้ได้ภายใต้เงื่อนไขบางประการ:

ด้วยการแปลยีนที่เป็นที่รู้จักของยีนที่รับผิดชอบในการพัฒนาโรคทางพันธุกรรม

ยีนของโรคต้องถูกโคลนและทราบลำดับนิวคลีโอไทด์

เป้าหมายของการวินิจฉัยดีเอ็นเอโดยตรงคือการระบุอัลลีลที่กลายพันธุ์

ดังนั้น ในสถานการณ์ที่ทราบว่าความเสียหายของ DNA ชนิดใดนำไปสู่โรคทางพันธุกรรม ชิ้นส่วน DNA ที่มีความเสียหายจะถูกตรวจสอบโดยตรง กล่าวคือ ใช้วิธีการวินิจฉัย DNA โดยตรง

อย่างไรก็ตามจนถึงปัจจุบันยังไม่มีการทำแผนที่ยีนของโรคต่างๆ การจัดระเบียบ exon-intron ไม่เป็นที่รู้จัก และโรคทางพันธุกรรมจำนวนมากมีลักษณะเฉพาะด้วยความแตกต่างทางพันธุกรรมที่เด่นชัดซึ่งไม่อนุญาตให้ใช้วิธีการวินิจฉัยดีเอ็นเอโดยตรงอย่างเต็มรูปแบบ ดังนั้นในกรณีที่ไม่ทราบการแปลความเสียหายจึงใช้วิธีการที่แตกต่างกันซึ่งเกี่ยวข้องกับการศึกษาบริเวณใกล้เคียงของยีนที่รับผิดชอบต่อโรคยีนร่วมกับการวิเคราะห์ครอบครัวนั่นคือวิธีการวินิจฉัยทางอ้อมของยีน มีการใช้โรคทางพันธุกรรม

สามารถใช้วิธีการต่างๆ ในการตรวจจับการกลายพันธุ์ของจุดและการลบเพียงเล็กน้อย แต่วิธีการทั้งหมดนั้นใช้วิธีการ PCR ปฏิกิริยานี้ทำให้คุณสามารถคูณลำดับนิวคลีโอไทด์ของ DNA ได้ซ้ำแล้วซ้ำเล่า จากนั้นจึงค้นหาการกลายพันธุ์ วิธีการค้นหาชิ้นส่วนดีเอ็นเอที่มีการกลายพันธุ์ขึ้นอยู่กับ การวิเคราะห์เปรียบเทียบลำดับนิวคลีโอไทด์ของดีเอ็นเอกลายพันธุ์และปกติ

การวิเคราะห์ผลิตภัณฑ์ PCR

ในกระบวนการตรวจดีเอ็นเอโดยตรง

มันเกี่ยวข้องกับการศึกษาคุณสมบัติเฉพาะของบริเวณที่ขยายของยีน ดังนั้นในโรคที่เกิดจากการขยายตัวของการเกิดซ้ำของไตรนิวคลีโอไทด์ ผลิตภัณฑ์การขยายเสียงจะมีความยาวต่างกัน (สะท้อนถึงจำนวนแฝดสามที่แตกต่างกันในบริเวณยีนที่ศึกษา) และเป็นผลให้ความเร็วของการเคลื่อนที่ในเจล ด้วยเหตุนี้การแยกอิเล็กโตรโฟเรติกที่ชัดเจนของอัลลีลปกติและอัลลีลที่กลายพันธุ์และการกำหนดที่แม่นยำของชิ้นส่วนที่ยืดออกทางพยาธิวิทยาเช่น การวินิจฉัย DNA ของโรคทำได้สำเร็จ (รูปที่ 13)

https://pandia.ru/text/78/085/images/image018_18.jpg" width="417" height="110 src=">

ข้าว. 14. การวินิจฉัยการลบ ปิดปาก ในยีน DYT 1 ในผู้ป่วยโรคดีสโทเนียที่ไม่ขึ้นกับโดปา (โพลีอะคริลาไมด์เจลอิเล็กโตรโฟรีซิส) เพลง 2,3,6 - ป่วย; เลน 1,4,5 - การควบคุม ลูกศรเส้นเล็กแสดงถึงอัลลีลปกติ ลูกศรตัวหนาบ่งชี้อัลลีลที่สั้นกว่ากลายพันธุ์ (การลบนิวคลีโอไทด์สามตัว)

หากขอบเขต DNA ที่อยู่ระหว่างการศึกษารวมอยู่ในการลบเพิ่มเติมทั้งหมด การขยาย PCR ของ DNA จากอัลลีลที่ถูกลบจะไม่ถูกดำเนินการเนื่องจากไม่มีที่สำหรับการผสมไพรเมอร์ ในกรณีนี้ การลบ homozygous จะได้รับการวินิจฉัยตาม ขาดทั้งหมดผลิตภัณฑ์จากปฏิกิริยา PCR (การสังเคราะห์ DNA เป็นไปไม่ได้จากสำเนาของยีนทั้งสองชุด) ด้วยการลบแบบ heterozygous เป็นไปได้ที่จะระบุผลิตภัณฑ์ PCR ที่สังเคราะห์จากอัลลีลปกติ (ปลอดภัย) อย่างไรก็ตาม เพื่อการวินิจฉัยที่เชื่อถือได้ของการกลายพันธุ์ดังกล่าว จำเป็นต้องใช้วิธีการสร้างภาพดีเอ็นเอที่ซับซ้อนมากขึ้น เพื่อให้สามารถประมาณปริมาณของ ผลิตภัณฑ์ PCR สุดท้าย

ในการตรวจจับการกลายพันธุ์ของจุด (ส่วนใหญ่มักจะแทนที่นิวคลีโอไทด์) ที่ไซต์บางแห่ง วิธี PCR จะถูกใช้ร่วมกับวิธีอื่นๆ ของการวิเคราะห์อณูพันธุศาสตร์ หากทราบตำแหน่งการโลคัลไลเซชันและลักษณะของการกลายพันธุ์ของจุดที่เสนออย่างแม่นยำ ดังนั้นสำหรับการตรวจจับการกลายพันธุ์ดังกล่าวอย่างมีจุดมุ่งหมาย เอ็นโดนิวคลีเอสจำกัด (ข้อจำกัด) เป็นเอนไซม์เซลล์พิเศษที่แยกได้จากแบคทีเรียหลายสายพันธุ์

เอนไซม์เหล่านี้รู้จักลำดับนิวคลีโอไทด์จำเพาะตั้งแต่ความยาวสี่ถึงสิบนิวคลีโอไทด์ จากนั้น การจำกัด (lat. (การตัด)) ของลำดับเหล่านี้จะดำเนินการโดยเป็นส่วนหนึ่งของโมเลกุล DNA ที่มีเกลียวคู่ เอ็นไซม์การจำกัดแต่ละตัวจะรับรู้และตัดลำดับนิวคลีโอไทด์จำเพาะที่กำหนดไว้อย่างเคร่งครัดในที่คงที่ - ไซต์ข้อจำกัด (ไซต์การรับรู้)

ในกรณีที่การกลายพันธุ์แบบจุดเปลี่ยนตำแหน่งตามธรรมชาติของการรู้จำสำหรับเอ็นไซม์การจำกัดเฉพาะ เอ็นไซม์นั้นจะไม่สามารถตัดแยกชิ้นส่วนที่ขยายด้วย PCR ที่กลายพันธุ์ได้ ในบางกรณี การกลายพันธุ์นำไปสู่การปรากฏตัวของตำแหน่งการจดจำใหม่สำหรับเอนไซม์จำกัดเฉพาะ ซึ่งไม่มีอยู่ในบรรทัดฐาน

ในทั้งสองสถานการณ์ ผลิตภัณฑ์ PCR ที่กลายพันธุ์และปกติที่บำบัดด้วยเอ็นไซม์การจำกัดที่เลือกไว้จะให้ชิ้นส่วนจำกัดที่มีความยาวต่างกัน ซึ่งสามารถตรวจพบได้ง่ายโดยอิเล็กโตรโฟรีซิส (รูปที่ 15)

ดังนั้น หากจำเป็นต้องตรวจจับการกลายพันธุ์ของจุดใดจุดหนึ่งอย่างรวดเร็ว ภารกิจก็จะลดลงเหลือเพียงการค้นหาเอ็นไซม์การจำกัดที่เกี่ยวข้อง ซึ่งตำแหน่งการรู้จำนั้นถูกแปลที่ตำแหน่งที่มีลำดับนิวคลีโอไทด์ที่ถูกรบกวน การบำบัดผลิตภัณฑ์ PCR ด้วยเอ็นไซม์จำกัดนี้จะช่วยให้แยกแยะอัลลีลปกติและอัลลีลที่กลายพันธุ์ได้ง่าย การวิเคราะห์ข้อจำกัดช่วยลดความยุ่งยากในการตรวจหาการกลายพันธุ์ของจุดที่รู้จัก และปัจจุบันใช้กันอย่างแพร่หลายสำหรับการวินิจฉัยดีเอ็นเอโดยตรงของโรคทางพันธุกรรม

ขั้นตอนสุดท้าย การวิเคราะห์ทางอณูพันธุศาสตร์ของการกลายพันธุ์คือการกำหนดลำดับนิวคลีโอไทด์ของชิ้นส่วนดีเอ็นเอที่ศึกษา (การจัดลำดับ) ซึ่งเปรียบเทียบกับบรรทัดฐานและกำหนดการวินิจฉัยทางพันธุกรรมขั้นสุดท้าย ด้วยความก้าวหน้าในพันธุศาสตร์ระดับโมเลกุล ปัจจุบันวิธีการวินิจฉัยดีเอ็นเอได้รับการพัฒนาสำหรับโรคทางพันธุกรรมมากกว่า 400 โรค

ข้าว. 15. การตรวจจับการกลายพันธุ์ของจุดโดยใช้การวิเคราะห์ข้อจำกัด:เอ - บริเวณที่ขยายได้ของยีนที่มีไซต์ข้อ จำกัดAGCTสำหรับการจำกัดเอ็นโดนิวคลีเอสอลู ผม. การกลายพันธุ์จี→ อาเปลี่ยนลำดับนิวคลีโอไทด์นี้ส่งผลให้เกิดการจำกัดเอ็นไซม์อาลุยถูกบล็อก; B - อิเล็กโตรฟีโรแกรมของผลิตภัณฑ์ข้อ จำกัด : เลน 1 - homozygosity สำหรับอัลลีลปกติ เลน 2, homozygosity สำหรับการกลายพันธุ์; เลน 3 - สถานะต่างกัน (อัลลีลปกติ + การกลายพันธุ์)

การวินิจฉัยโรคทางพันธุกรรมจากการตรวจอัลลีลที่กลายพันธุ์โดยตรงในผู้ป่วย สมาชิกในครอบครัว หรือพาหะนำโรค heterozygous ที่สันนิษฐานว่ามีการกลายพันธุ์ทางพยาธิวิทยา เหมาะสำหรับการวินิจฉัยก่อนแสดงอาการและก่อนคลอด ซึ่งสามารถประยุกต์ใช้ได้มากที่สุด ระยะแรกพัฒนาการของทารกในครรภ์ก่อนที่จะมีอาการทางคลินิกหรือทางชีวเคมีของโรค

โดยไม่คำนึงถึงวิธีการตรวจหาการกลายพันธุ์ การกำหนดลักษณะโมเลกุลที่แม่นยำของการกลายพันธุ์แต่ละครั้งสามารถทำได้โดยการหาลำดับโดยตรงเท่านั้น เพื่อให้กระบวนการนี้เป็นไปโดยอัตโนมัติ ในช่วงไม่กี่ปีที่ผ่านมามีการใช้อุปกรณ์พิเศษอย่างแพร่หลาย - ซีเควนเซอร์ ซึ่งช่วยให้กระบวนการอ่านข้อมูลดีเอ็นเอเร็วขึ้นอย่างมาก

แนวทางสำหรับการประยุกต์ใช้การวิจัยทางอณูชีววิทยาในห้องปฏิบัติการวินิจฉัยทางคลินิกในวงกว้างนั้นเปิดกว้างขึ้นโดยเร่งกระบวนการวิเคราะห์โดยดำเนินการตามขั้นตอนทั้งหมดในความต่อเนื่องเดียว โดยไม่ต้องถ่ายโอนตัวอย่าง สร้างเงื่อนไขในการป้องกันการปนเปื้อนระหว่างการทดสอบคู่ขนานของการวิเคราะห์จำนวนหนึ่งและการลงทะเบียนที่มีวัตถุประสงค์ ของผลลัพธ์ในแต่ละรอบ

การปรับเปลี่ยนหลักของวิธี PCR

ใช้เพื่อสแกนและค้นหาการกลายพันธุ์ของยีนที่ทราบอย่างรวดเร็ว

มัลติเพล็กซ์ (มัลติไพรเมอร์) PCR

วิธีนี้ใช้การขยายเสียงพร้อมกันของยีนที่ศึกษาหลายตัวพร้อมกันในปฏิกิริยาเดียว วิธีนี้ช่วยให้สามารถคัดกรองการกลายพันธุ์ที่พบบ่อยที่สุดได้อย่างรวดเร็วอย่างประหยัด ตัวอย่างเช่น เพื่อวินิจฉัยการขนส่งของการลบอย่างรวดเร็วในยีน dystrophin ในผู้ป่วยโรคกล้ามเนื้อเสื่อมชนิด Duchenne/Becker แบบก้าวหน้า การขยายชุดของ exon ที่กลายพันธุ์บ่อยที่สุดของยีนนี้พร้อมกันจะดำเนินการ เนื่องจากโรคเหล่านี้สืบทอดมาจาก X-linked recessive และเกี่ยวข้องกับความเสียหายต่อโครโมโซม X เพียงตัวเดียวในเด็กผู้ชาย ในกรณีของการลบออกเป็นเวลานาน อิเล็กโตรโฟรีซิสของผลิตภัณฑ์จากปฏิกิริยาจะเผยให้เห็นว่าไม่มีชิ้นส่วน DNA อย่างน้อยหนึ่งชิ้น (เอ็กซอน) ) ซึ่งสามารถใช้เป็นเครื่องยืนยันการวินิจฉัยระดับโมเลกุล นอกจากนี้ โดยการเลือกขอบเขตยีนเฉพาะสำหรับการขยาย PCR ทำให้สามารถประเมินความยาวรวมของการลบและจุดแตกหักของยีนได้อย่างแม่นยำ (จนถึง exon)

การใช้ปฏิกิริยามัลติเพล็กซ์ร่วมกันทำให้สามารถวินิจฉัยได้ถึง 98% ของการลบทั้งหมดที่เกิดขึ้นในผู้ป่วยโรคกล้ามเนื้อเสื่อมแบบก้าวหน้า Duchenne/Becker นี่คือประมาณ 60% ของ จำนวนทั้งหมดการกลายพันธุ์ที่ทราบในยีน dystrophin และบ่งชี้ว่าวิธีการตรวจคัดกรองนี้มีประสิทธิภาพสูงมากสำหรับการวินิจฉัยดีเอ็นเอของ dystrophinopathy (รูปที่ 16)

ข้าว. 16. การวินิจฉัยโดยตรงของ DNA ของ Duchenne กล้ามเนื้อ dystrophy โดยใช้ multiplex PCR (agarose gel electrophoresis) ในแต่ละบุคคลที่ตรวจสอบ ยีน dystrophin สี่ตัวได้รับการขยายพร้อมกัน (exons 17, 19, 44 และ 45; ลูกศรระบุผลิตภัณฑ์การขยายเสียงที่เกี่ยวข้อง) เลน 1 - การควบคุมเลน 2-5 - ผู้ป่วยที่มี Duchenne กล้ามเนื้อเสื่อมด้วยการลบยีน dystrophin ต่างๆ (เลน 2 และ 5 - การลบ exon 45 เลน 3 - การลบ exon 44 เลน 4 - การลบ exon 17 และ 19 ).

การขยายสัญญาณเฉพาะอัลลีล

วิธีการนี้ขึ้นอยู่กับการใช้ไพรเมอร์อิสระสองคู่สำหรับภูมิภาคเฉพาะของยีน: ไพรเมอร์หนึ่งตัวในทั้งสองคู่เป็นเรื่องธรรมดา และไพรเมอร์ที่สองในแต่ละคู่มีโครงสร้างที่แตกต่างกันและประกอบกับลำดับดีเอ็นเอปกติหรือกลายพันธุ์ . เป็นผลมาจากปฏิกิริยาดังกล่าวในสารละลาย ผลิตภัณฑ์ PCR สองประเภทสามารถสังเคราะห์ได้พร้อมกัน - ปกติและกลายพันธุ์ นอกจากนี้ การออกแบบไพรเมอร์ที่ใช้ทำให้สามารถแยกความแตกต่างของผลิตภัณฑ์การขยายเสียงแบบปกติและแบบกลายพันธุ์ได้อย่างชัดเจนด้วยขนาดโมเลกุล วิธีนี้ชัดเจนมากและช่วยให้คุณตรวจสอบการขนส่งอัลลีลกลายพันธุ์ทั้งแบบโฮโม-และเฮเทอโรไซกัสได้

วิธีการสำหรับการปรับเปลี่ยน DNA แบบขยายโดยตรงที่ไซต์

วิธีการนี้ขึ้นอยู่กับการใช้ใน PCR ของไพรเมอร์ที่ไม่ตรงกันที่เรียกว่าไพรเมอร์ (ไม่ใช่ส่วนประกอบที่สมบูรณ์กับเทมเพลต) ซึ่งแตกต่างจากลำดับดีเอ็นเอของเทมเพลตโดยหนึ่งนิวคลีโอไทด์ อันเป็นผลมาจากการรวมไพรเมอร์ที่ระบุในองค์ประกอบของผลิตภัณฑ์ PCR ที่กลายพันธุ์ทำให้เกิดไซต์การ จำกัด ที่สร้างขึ้นเทียมสำหรับหนึ่งในเอ็นโดนิวคลีเอสการ จำกัด ซึ่งช่วยให้สามารถวินิจฉัยดีเอ็นเอโดยตรงของการกลายพันธุ์ที่รู้จักโดยใช้การวิเคราะห์ข้อ จำกัด การสร้างไซต์จำกัดเทียมดังกล่าวอาจมีความจำเป็นหากการค้นหาไม่เปิดเผยการมีอยู่ของเอนไซม์ที่รู้จักและเข้าถึงได้ ไซต์จำกัด "ตามธรรมชาติ" ซึ่งได้รับผลกระทบจากการปรากฏตัวของการกลายพันธุ์ที่ศึกษาในโมเลกุลดีเอ็นเอ .

วิธี PCR ทรานสคริปเทสแบบย้อนกลับ (RT- PCR)

วิธีนี้ใช้ในกรณีที่สะดวกกว่าที่จะใช้ไม่ใช่จีโนม DNA เป็นเป้าหมายของการศึกษา แต่ได้รับ cDNA "อิ่มตัว" ที่มีขนาดกะทัดรัดและให้ข้อมูลมากขึ้นหลังจากการประมวลผลตัวอย่างเนื้อเยื่ออย่างเหมาะสม เช่น วัสดุชิ้นเนื้อหรือเซลล์ของลิมโฟไซต์ , ไฟโบรบลาสต์ ฯลฯ สิ่งสำคัญ เงื่อนไขที่นี่คือการแสดงออก (อย่างน้อยน้อยที่สุด) ของยีนที่ต้องการในเนื้อเยื่อภายใต้การศึกษา

ในขั้นตอนแรก การทำสำเนาย้อนกลับของ mRNA จะดำเนินการ และโมเลกุล cDNA ที่ได้จะทำหน้าที่เป็นแม่แบบสำหรับ PCR ต่อจากนั้น บริเวณ cDNA วิกฤตที่ขยายออกในปริมาณที่เพียงพอจะถูกจัดลำดับและวิธีการคัดกรองการกลายพันธุ์อื่นๆ การศึกษาอิเล็กโตรโฟเรติกโดยตรง (การตรวจจับการลบ การแทรก ฯลฯ) หรือการผสานเข้ากับระบบการแสดงออกเพื่อให้ได้ผลิตภัณฑ์โปรตีนและการวิเคราะห์โดยตรง .

วิธีนี้มีประสิทธิภาพโดยเฉพาะอย่างยิ่งสำหรับการตรวจจับการกลายพันธุ์ที่นำไปสู่การสังเคราะห์โปรตีนที่ "ถูกตัดทอน" (การกลายพันธุ์ที่ไร้สาระ การกลายพันธุ์แบบประกบ การลบจำนวนมาก) - การวิเคราะห์ PTT (การทดสอบการตัดทอนโปรตีน) ที่เรียกว่า การวิเคราะห์ปตท. มักใช้ในการตรวจสอบยีน multi-exon ที่ขยายออกไป เช่น ยีนสำหรับ Duchenne/Becker กล้ามเนื้อ dystrophy, ataxia-telangiectasia หรือ neurofibromatosis ชนิดที่ 1

PCR แบบเรียลไทม์(PCR เรียลไทม์)

ทุกปีในการดูแลสุขภาพภาคปฏิบัติ PCR แบบเรียลไทม์กำลังกลายเป็นวิธีการวินิจฉัยที่ได้รับความนิยมมากขึ้นเรื่อยๆ คุณลักษณะพื้นฐานของมันคือการตรวจสอบและการวิเคราะห์เชิงปริมาณของการสะสมของผลิตภัณฑ์ปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรสและการลงทะเบียนอัตโนมัติและการตีความผลลัพธ์ วิธีนี้ไม่ต้องการขั้นตอนอิเล็กโตรโฟรีซิส ซึ่งลดข้อกำหนดสำหรับห้องปฏิบัติการ PCR ด้วยการประหยัดพื้นที่ในการผลิต จำนวนบุคลากรที่ลดลง และความต้องการการหาปริมาณ DNA/RNA วิธีนี้จึงถูกนำมาใช้อย่างประสบความสำเร็จในช่วงไม่กี่ปีที่ผ่านมาในศูนย์ระบาดวิทยา การวินิจฉัย และการวิจัยด้านสุขอนามัยที่ใหญ่ที่สุดในประเทศที่พัฒนาแล้วของโลก แทนที่ PCR ในรูปแบบปัจจุบัน ("คลาสสิก")

PCR แบบเรียลไทม์ใช้โพรบโอลิโกนิวคลีโอไทด์ที่ติดฉลากเรืองแสงเพื่อตรวจจับ DNA ระหว่างการขยายสัญญาณ PCR แบบเรียลไทม์ช่วยให้วิเคราะห์ตัวอย่างได้อย่างสมบูรณ์ภายใน 20-60 นาที และสามารถตรวจจับได้แม้กระทั่งโมเลกุล DNA หรือ RNA เดียวในตัวอย่างในทางทฤษฎี

ข้าว. 17. PCR แบบเรียลไทม์

PCR แบบเรียลไทม์ใช้ระบบ TaqMan เพื่อควบคุมจลนพลศาสตร์ PCR โดยตรงในระหว่างการขยายสัญญาณโดยใช้การดับการเรืองแสงด้วยเรโซแนนซ์ สำหรับการตรวจจับ จะใช้โพรบที่มีฟลูออโรฟอร์และตัวดับที่ส่วนตรงกลางของชิ้นส่วนที่ขยายสัญญาณ เมื่อฟลูออโรฟอร์และสารดับเพลิงจับกับโพรบโอลิโกนิวคลีโอไทด์ จะมีการปล่อยฟลูออเรสเซนต์เพียงเล็กน้อยเท่านั้น ในระหว่างกระบวนการขยายสัญญาณ เนื่องจากกิจกรรม 5'-exonuclease ของ Taq polymerase ฉลากเรืองแสงจะผ่านเข้าไปในสารละลาย ถูกปล่อยออกจากบริเวณใกล้เคียงเครื่องดับ และสร้างสัญญาณเรืองแสงที่จะเพิ่มขึ้นตามเวลาจริงตามสัดส่วนของการสะสมของ ขยายเสียง (รูปที่ 17)

ข้อได้เปรียบหลักของ PCR-Real-Time เหนือ PCR ด้วยเจลอิเล็กโตรโฟรีซิส:

วิธีการทั้งหมดเกิดขึ้นในหลอดทดลองเดียว

· วิธีการใช้เวลา 1 ชั่วโมง;

เพียงพอ 1-2 ห้องทำงาน;

ควบคู่ไปกับการประเมินผลลัพธ์เชิงคุณภาพ เราสามารถหาปริมาณได้ (เช่น เมื่อกำหนดให้ยาต้านไวรัสสำหรับโรคเอดส์หรือไวรัสตับอักเสบ จำเป็นต้องทราบปริมาณไวรัส คือ ปริมาณไวรัสต่อ 1 หน่วย ซึ่งให้จริง -PCR เวลา);

· ลดความเสี่ยงของการปนเปื้อนอย่างมาก

บทสรุป

วิธี PCR เป็นหนึ่งในวิธีการวิจัยทางอณูชีววิทยาที่พบบ่อยที่สุด แพทย์ควรใช้วิธีนี้อย่างมีความหมาย และแพทย์ที่ตัดสินใจใช้ PCR ในงานของเขาจะต้องมีความรู้บางประการเกี่ยวกับคุณสมบัติและความสามารถของวิธีนี้ ประการที่สอง จะต้องมีการตอบรับอย่างใกล้ชิดระหว่างแพทย์และห้องปฏิบัติการ PCR ซึ่งจำเป็นสำหรับการวิเคราะห์กรณีที่ซับซ้อนและการพัฒนากลยุทธ์การวินิจฉัยที่ถูกต้อง ประการที่สาม การวิเคราะห์ PCR ไม่ใช่ยาครอบจักรวาลในการวินิจฉัย (โดยหลักคือโรคติดเชื้อ) และไม่ได้แทนที่วิธีการวิจัยที่มีอยู่ แต่ช่วยเติมเต็มเท่านั้น และที่สำคัญที่สุด PCR ไม่สามารถแทนที่สัญชาตญาณและความคิดเชิงวิเคราะห์ที่แพทย์ที่คาดหวังความสำเร็จควรมี

พี . ส . การวิจัยระดับโมเลกุล-ชีววิทยา - การเปลี่ยนแปลงจุดอ้างอิงของการวินิจฉัยและการรักษา การใช้วิธีการทางอณูชีววิทยาสัมพันธ์กับการเปลี่ยนแปลงครั้งใหญ่โดยเน้นที่การวินิจฉัยทางห้องปฏิบัติการ เราสามารถพูดคุยเกี่ยวกับข้อมูลที่ทันท่วงที แต่เกี่ยวกับการรับล่วงหน้า หากตอนนี้การศึกษาในห้องปฏิบัติการในกรณีส่วนใหญ่ดำเนินการไปแล้วโดยเริ่มมีโรคและการรักษาขั้นสูงแล้ว คาดว่าข้อมูลทางห้องปฏิบัติการทางอณูชีววิทยาจะช่วยให้สามารถระบุความชอบของบุคคลต่อพยาธิวิทยาบางประเภทและระดับความไวต่อยาบางชนิดได้ จะช่วยให้พิสูจน์ลักษณะการทำนายป้องกันและเป็นส่วนตัวของยาในอนาคต

การเปลี่ยนแปลงของการวินิจฉัยและการรักษาที่มุ่งเน้น

โรคทางพันธุกรรม

วันนี้ในอนาคต

การวินิจฉัย หนังสือเดินทางทางพันธุกรรม

8. ห้องปฏิบัติการ PCR ที่มีการตรวจจับการเรืองแสงจำเป็นต้องมีห้องทำงานกี่ห้อง (การวิเคราะห์เชิงปริมาณ, PCR แบบเรียลไทม์)

9. การตรวจจับคืออะไร?

10. วิธีการวินิจฉัยดีเอ็นเอแตกต่างกันอย่างไร?

11. เอ็นไซม์ใดทำงานบนพื้นฐานของ PCR?

12. ทำไมจึงต้องแยกโซนการตรวจจับออกจากโซนงานอื่น?

13. ไซต์ข้อจำกัดคืออะไร?

14. วิธีการวินิจฉัย DNA โดยตรงกับวิธีทางอ้อมแตกต่างกันอย่างไร?

15. การจัดลำดับคืออะไร?

16. มัลติเพล็กซ์ PCR คืออะไร?

17. PCR กำหนดประเภทของการกลายพันธุ์แบบใด?

18. การปนเปื้อนคืออะไร?

19. สาระสำคัญของวิธีการขยายสัญญาณเฉพาะอัลลีลคืออะไร?

20. สภาวะการเก็บรักษาวัสดุ PCR?

21. อุปกรณ์ใดใช้สำหรับขยายสัญญาณ?

22. วิธีการ Reverse transcriptase PCR (RT-PCR) คืออะไร?

23. อะไรคือวัสดุสำหรับการวินิจฉัย PCR?

24. ระบุประเภทของการปนเปื้อน?

แบบทดสอบเพื่อการศึกษาด้วยตนเอง

1. เอ็นโดนิวคลีเอสจำกัด:

ก) เอนไซม์ที่ "ทำลาย" ดีเอ็นเอในสถานที่เฉพาะอย่างเคร่งครัด

b) เอ็นไซม์ที่เย็บแตกในโมเลกุลดีเอ็นเอ

c) เอ็นไซม์ที่ให้สารประกอบที่ทำการซ่อมแซมดีเอ็นเอ

2. การขยายพันธุ์ของยีน:

3. วิธีใดของอณูพันธุศาสตร์ที่ใช้ในการวินิจฉัยโรคที่เกิดจากยีนกลายพันธุ์ของลำดับที่รู้จัก

ก) การใช้ข้อจำกัดเฉพาะ

b) การตรวจจับโดยตรงโดยใช้หัววัดระดับโมเลกุลเฉพาะ

c) การวิเคราะห์ครอบครัวของการแจกแจงความแตกต่างของความยาวส่วนจำกัดปกติ

4. การจัดลำดับดีเอ็นเอ:

ก) การระบุลำดับเบสของดีเอ็นเอ

b) การทำซ้ำส่วน DNA ซ้ำ ๆ

c) การแยกชิ้นส่วน DNA ที่มียีนที่ศึกษา

5. สามารถรับตัวอย่าง DNA ได้โดยใช้ :

b) chorionic villi;

c) น้ำคร่ำ

ง) เซลล์น้ำคร่ำ

จ) การตัดชิ้นเนื้อของผิวหนัง, กล้ามเนื้อ, ตับ,

e) ทุกอย่างถูกต้อง ยกเว้นจุด "c"

g) ทุกอย่างถูกต้องยกเว้นจุด "d"

h) ทั้งหมดข้างต้นถูกต้อง

6. การกลายพันธุ์ใดที่ได้รับการวินิจฉัยโดย PCR?

ก) จีโนม;

b) โครโมโซม;

c) ยีน (จุด)

7. ไพรเมอร์คือ:

ก) ส่วนเสริมของ DNA;

b) ลำดับโอลิโกนิวคลีโอไทด์สังเคราะห์ที่ติดฉลาก (กัมมันตภาพรังสีหรือฟลูออเรสเซนต์) ประกอบกับยีนกลายพันธุ์หรือยีนปกติ

c) โอลิโกนิวคลีโอไทด์ที่ทำหน้าที่เป็น "เมล็ดพันธุ์" และเริ่มต้นการสังเคราะห์ของสายพอลินิวคลีโอไทด์บนแม่แบบ DNA หรือ RNA

8. ใครเป็นคนพัฒนาหลักการของวิธี PCR?

b) K. Mullis

9. วิธี PCR ใช้ในการวินิจฉัยการขยายตัวของการเกิดซ้ำของไตรนิวคลีโอไทด์ (ชนิดไดนามิกของการกลายพันธุ์) หรือไม่?

10. PCR ใช้ในด้านใดบ้าง?

ก) การแพทย์ทางคลินิก

b) คำจำกัดความของสิ่งมีชีวิตดัดแปลงพันธุกรรม (GMOs)

ค) การระบุตัวบุคคล การสถาปนาความเป็นพ่อ อาชญากร

ง) ทั้งหมดข้างต้น

d) ไม่มีสิ่งใดข้างต้น

ตัวอย่างคำตอบ: 1 - เอ; 2 - ข; 3 - ข; 4 - เอ; 5 - อี; 6 - ใน; 7 - ใน; 8 - ข; 9 – ก, 10 – ง.

หลัก

1. พันธุศาสตร์ Bochkov มอสโก จีโอตาร์, 2002.

เพิ่มเติม

1., Bakharev และการรักษาโรคที่มีมา แต่กำเนิดและกรรมพันธุ์ในเด็ก - มอสโก 2547

2. การวินิจฉัยดีเอ็นเอและการให้คำปรึกษาทางพันธุกรรมทางการแพทย์ - มอสโก 2547

3. พันธุกรรม Ginter - มอสโก, 2546.

4. Gorbunov พื้นฐานของพันธุศาสตร์การแพทย์ - เซนต์ปีเตอร์สเบิร์ก: Intermedica, 1999.

5. เจ. แมคกี้. โมเลกุล การวินิจฉัยทางคลินิก. – โลก, 1999.

6. Menshikov - การวิจัยทางชีววิทยาในการวินิจฉัยทางห้องปฏิบัติการทางคลินิก: ความเป็นไปได้ของปัญหา (บรรยาย) คลินิก การวินิจฉัยทางห้องปฏิบัติการ, № 3, 2006.

7. Kornienko ของห้องปฏิบัติการ PCR ระหว่างการวิเคราะห์วัสดุชีวภาพแบบอินไลน์ การวินิจฉัยทางห้องปฏิบัติการทางคลินิก ครั้งที่ 10 พ.ศ. 2549

8. การจัดระเบียบการทำงานของห้องปฏิบัติการ PCR คำแนะนำที่เป็นระเบียบ หมู่ 1.3.1794-03. หัวหน้าแพทย์สุขาภิบาลแห่งสหพันธรัฐรัสเซีย พ.ศ. 2546

9. เทคโนโลยี Erlich H.A. PCR – Percin-Elmer Cetus, 1993.

10. Heid C. A. , Stevens J. PCR เชิงปริมาณแบบเรียลไทม์ ความละเอียดของจีโนม - ครั้งที่ 6, 2539.

หลักการสำคัญของวิธีการ

ปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรส

คู่มือระเบียบวิธีการทำงานนอกหลักสูตรของนักเรียน 3-4 หลักสูตรในสาขาอายุรศาสตร์ทั่วไป (060101) และกุมารเวชศาสตร์ (060103)

SEI HPE "สถาบันการแพทย์แห่งรัฐครัสโนยาสค์ของหน่วยงานรัฐบาลกลางเพื่อการพัฒนาด้านสุขภาพและสังคม"

รัสเซีย, ครัสโนยาสค์,

ปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรสเป็นที่ทราบกันดีอยู่แล้วว่า 30 ปี มีการใช้กันอย่างแพร่หลายในหลายสาขาตั้งแต่โบราณคดีจนถึงพันธุศาสตร์

เป็นวิธีการ PCR ที่ช่วยในการสร้างความเป็นพ่อ แต่มักใช้ในการตรวจหาโรคติดเชื้อต่างๆ ในร่างกายมนุษย์

การวิเคราะห์ PCR ดำเนินการอย่างไร และเป็นอย่างไร เราจะพยายามตอบคำถามเหล่านี้อย่างละเอียด

การวิเคราะห์ PCR - มันคืออะไร?

ปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรส (PCR) เป็นวิธีการวินิจฉัยทางอณูพันธุศาสตร์ที่มีความแม่นยำสูง ซึ่งทำให้สามารถตรวจหาโรคติดเชื้อและโรคทางพันธุกรรมต่างๆ ในมนุษย์ได้ ทั้งในระยะเฉียบพลันและเรื้อรัง และนานก่อนที่โรคจะแสดงออกมาเอง

วิธี PCR มีความเฉพาะเจาะจงอย่างยิ่ง และดำเนินการอย่างถูกต้อง ไม่สามารถให้ผลบวกที่ผิดพลาดได้ นั่นคือถ้าไม่มีการติดเชื้อ การวิเคราะห์จะไม่แสดงว่ามีการติดเชื้อ ดังนั้นบ่อยครั้งมากเพื่อยืนยันการวินิจฉัยจึงทำการวิเคราะห์ PCR เพิ่มเติมเพื่อกำหนดเชื้อโรคและลักษณะของเชื้อโรค

ปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรส (PCR) ได้รับการพัฒนาในปี 1983 โดย Cary Mullis (สหรัฐอเมริกา) ซึ่งเขาได้รับรางวัลโนเบลสาขาเคมีในปี 1993

ข้อดีของวิธีนี้คืออะไร?

การวินิจฉัยด้วยวิธีนี้ช่วยให้คุณค้นหาเชื้อโรคได้โดยตรงในยีนที่มีอยู่ในวัสดุที่ศึกษา นี่คือการวิเคราะห์ที่แม่นยำที่สุดสำหรับการติดเชื้อทางเพศ การติดเชื้อแฝง โรคติดต่อทางเพศสัมพันธ์ต่างๆ

ความแตกต่างระหว่างการวินิจฉัย PCR กับวิธีอื่นๆ การวิจัยในห้องปฏิบัติการ มีรายละเอียดดังนี้:

• วิธีการนี้มีจุดมุ่งหมายเพื่อระบุเชื้อโรคเอง
• การวินิจฉัยโดย PCR ทำได้หลากหลาย: เพื่อตรวจหาเชื้อโรคหลายชนิด
• โรคตัวอย่างทางชีวภาพของผู้ป่วยเพียงตัวอย่างเดียวก็เพียงพอแล้ว
• วิธีการนี้มีความไวสูงและไม่มีปฏิกิริยาข้ามอื่น ๆ

นอกจากนี้ ข้อดีของการวินิจฉัย PCR คือวัสดุทางชีวภาพของผู้ป่วยเหมาะสำหรับการวิเคราะห์: เลือด สารคัดหลั่งจากอวัยวะสืบพันธุ์ ปัสสาวะ น้ำอสุจิ

PCR smear สามารถตรวจพบการติดเชื้อใดได้บ้าง

อาจมีสารติดเชื้อจำนวนมากในร่างกาย รวมถึงสารที่ "ซ่อนเร้น" ซึ่งไม่ปรากฏให้เห็นเป็นเวลานาน

การวิเคราะห์รอยเปื้อน PCR ทำให้สามารถตรวจพบการติดเชื้อดังกล่าวได้:

• ureplasmosis ของอวัยวะสืบพันธุ์;
• เชื้อรา ();
• เริม;
• การปรากฏตัวของเซลล์มะเร็ง;
• ประเมินสถานะของฮอร์โมน

วัสดุที่ศึกษาสำหรับ PCR มักเป็นเสมหะ น้ำลาย ปัสสาวะ เลือด ก่อนทำการวิเคราะห์จำเป็นต้องเตรียมการอย่างรอบคอบโดยได้รับคำปรึกษาเบื้องต้นจากแพทย์

เลือดสำหรับ PCR มักจะบริจาคในขณะท้องว่าง การวิเคราะห์จะแสดงให้เห็นผลลัพธ์ที่ดีเมื่อนำวัสดุสำหรับการวิจัยมาจากคลองปากมดลูกหรือท่อปัสสาวะ ในกรณีนี้ ควรทำการวินิจฉัย PCR ไม่เกินหนึ่งวันหลังจากมีเพศสัมพันธ์

พันธุ์ PCR

PCR ถูกใช้ในหลายพื้นที่สำหรับการวิเคราะห์และในการทดลองทางวิทยาศาสตร์ มีวิธีการวิเคราะห์ที่แตกต่างกัน:

1. การถอดความแบบย้อนกลับ PCR(Reverse Transcription PCR, RT-PCR (ภาษาอังกฤษ)) - ใช้เพื่อขยาย แยก หรือระบุลำดับที่ทราบจากไลบรารี RNA
2. PCR กลับด้าน(Inverse PCR (ภาษาอังกฤษ)) - ใช้ในกรณีที่ทราบเฉพาะพื้นที่ขนาดเล็กภายในลำดับที่ต้องการเท่านั้น วิธีนี้มีประโยชน์อย่างยิ่งเมื่อจำเป็นต้องกำหนดลำดับที่อยู่ใกล้เคียงหลังจากที่ DNA ถูกแทรกเข้าไปในจีโนมแล้ว
3. Nested PCR ใช้เพื่อลดจำนวนผลิตภัณฑ์ข้างเคียงของปฏิกิริยา ใช้ไพรเมอร์สองคู่และทำปฏิกิริยาสองครั้งติดต่อกัน
4. PCR แบบไม่สมมาตร(อังกฤษ Asymmetric PCR) - ดำเนินการเมื่อจำเป็นต้องขยายหนึ่งในสายโซ่ของ DNA ดั้งเดิมเป็นหลัก ใช้ในเทคนิคการวิเคราะห์การจัดลำดับและการผสมข้ามพันธุ์
5. PCR เชิงปริมาณ(Quantitative PCR, Q-PCR (ภาษาอังกฤษ)) หรือ PCR แบบเรียลไทม์ - ใช้เพื่อสังเกตการวัดปริมาณของผลิตภัณฑ์ PCR เฉพาะในแต่ละรอบของปฏิกิริยาโดยตรง
6. Stepped PCR (Touchdown PCR (ภาษาอังกฤษ)) - การใช้วิธีนี้จะทำให้อิทธิพลของการจับไพรเมอร์ไม่จำเพาะเจาะจงลดลง
7. PCR เฉพาะกลุ่ม(PCR เฉพาะกลุ่มภาษาอังกฤษ) - PCR สำหรับลำดับที่เกี่ยวข้องภายในหนึ่งหรือระหว่างสปีชีส์ที่แตกต่างกัน โดยใช้ไพรเมอร์แบบอนุรักษ์นิยมสำหรับลำดับเหล่านี้

ถ้าลำดับนิวคลีโอไทด์ของแม่แบบเป็นที่รู้จักเพียงบางส่วนหรือไม่รู้จักเลย สามารถใช้ไพรเมอร์ที่เสื่อมสภาพได้ ลำดับดังกล่าวจะมีตำแหน่งที่เสื่อมโทรมซึ่งฐานใดๆ ก็สามารถตั้งอยู่ได้ ตัวอย่างเช่น ลำดับไพรเมอร์อาจเป็น: …ATH… โดยที่ H คือ A, T หรือ C

กำลังศึกษาวัสดุทางชีวภาพอะไรบ้าง?

สารชีวภาพและของเหลวของมนุษย์หลายชนิดสามารถใช้เป็นวัสดุสำหรับการวิจัย PCR ซึ่งสามารถตรวจพบ DNA แปลกปลอมของแบคทีเรียหรือ DNA หรือ RNA ของไวรัสได้:

1. ปัสสาวะ. สามารถใช้สำหรับแผลติดเชื้อของระบบทางเดินปัสสาวะในผู้ชายและอวัยวะปัสสาวะในผู้หญิง (ในผู้ชาย การใช้ปัสสาวะเป็นวัสดุทดแทนการขูดของเยื่อบุผิว)
2. เสมหะ. ใช้สำหรับการวินิจฉัยวัณโรคและน้อยกว่าสำหรับการวินิจฉัยรูปแบบทางเดินหายใจของหนองในเทียมและมัยโคพลาสโมซิส เสมหะในปริมาณ 15-20 มล. ถูกรวบรวมในขวดที่ผ่านการฆ่าเชื้อ (ทิ้ง)
3. ของเหลวชีวภาพ. น้ำต่อมลูกหมาก, เยื่อหุ้มปอด, ไขสันหลัง, น้ำคร่ำ, ของเหลวข้อต่อ, ล้างหลอดลม, น้ำลายตามข้อบ่งชี้
4. เศษเยื่อบุผิวจากเยื่อเมือก. มักใช้ในการวินิจฉัยโรคติดต่อทางเพศสัมพันธ์ (STDs) เช่น โรคหนองใน หนองในเทียม มัยโคพลาสโมซิส ยูเรียพลาสโมซิส ไตรโคโมแนส โรคการ์ดเนเรลโลซีส เริม และการติดเชื้ออื่นๆ ที่ส่งผลต่อเยื่อเมือก
5. การตรวจชิ้นเนื้อ ตัวอย่างชิ้นเนื้อของกระเพาะอาหารที่ใช้บ่อยที่สุดและ ลำไส้เล็กส่วนต้นเพื่อตรวจหาเชื้อเฮลิโคแบคเตอร์ ไพโลไร
6. เลือด พลาสม่า เซรั่ม. ใช้สำหรับการวิเคราะห์ PCR ของไวรัสตับอักเสบบี, ซี, ดี, จี, เริม, CMV, เอชไอวี, ยีนของมนุษย์

เตรียมตัวอย่างไรสำหรับการวิเคราะห์?

ความน่าเชื่อถือของผล PCR ขึ้นอยู่กับความถูกต้องของการส่งมอบวัสดุสำหรับการตรวจสอบโดยตรง วัสดุต้องไม่ปนเปื้อน มิฉะนั้น ผลการศึกษาจะไม่มีวัตถุประสงค์ คำแนะนำที่สำคัญที่สุดก่อนทำการทดสอบ PCR ได้แก่ข้อกำหนดต่อไปนี้:

1. ให้ปัสสาวะในตอนเช้าในภาชนะที่ปลอดเชื้อ
2. ต้องทำการตรวจเลือดเพื่อหาการติดเชื้อในขณะท้องว่างในตอนเช้า
3. คุณไม่ควรมีเพศสัมพันธ์ในวันก่อนการทดสอบ

ผลการวิเคราะห์จะพร้อมใน 1.5-2 วันหลังจากขั้นตอนที่เป็นปัญหา มีบางสถานการณ์ที่สามารถเตรียมผลลัพธ์ได้ในวันเดียวกัน

ถอดรหัสการวิเคราะห์ PRP

ขั้นตอนการตีความการศึกษาที่นำเสนอมีความโดดเด่นในเรื่องความเรียบง่าย สามารถรับผลการวิเคราะห์ PCR ได้ 1.5-2 วันหลังจากส่งมอบวัสดุ ในบางกรณี ผลลัพธ์จะพร้อมในวันแรก และนี่คือสิ่งที่อาจหมายถึง:

• ผลลัพธ์เชิงลบแสดงว่าวัสดุที่ได้รับการวินิจฉัยไม่มีสารติดเชื้อที่ต้องการ
• PCR บวกบ่งชี้ว่า DNA หรือ RNA ของเชื้อโรคมีอยู่ในร่างกายมนุษย์

ในบางกรณี การวัดเชิงปริมาณของจุลินทรีย์จะดำเนินการ โดยเฉพาะอย่างยิ่งในโรคที่เกิดจากเชื้อโรคฉวยโอกาส เนื่องจากแบคทีเรียเหล่านี้แสดงผลด้านลบต่อเมื่อมีมากเกินไปเท่านั้น

นอกจากนี้ การวิเคราะห์ PCR เชิงปริมาณยังมีความสำคัญต่อการเลือกกลยุทธ์การรักษาและเพื่อวัตถุประสงค์ในการติดตามการรักษาดังกล่าว การติดเชื้อไวรัสเช่น HIV และไวรัสตับอักเสบ

PCR วินิจฉัยการติดเชื้อได้แม่นยำแค่ไหน?

วิธี PCR มีลักษณะเฉพาะด้วยความแม่นยำสูง ความจำเพาะ และความไวสูง หมายความว่า บทวิเคราะห์นี้สามารถ:

• ตรวจสอบการมีหรือไม่มีการติดเชื้ออย่างถูกต้อง
• ระบุชนิดของการติดเชื้อ (ความจำเพาะ);
• ตรวจพบการติดเชื้อแม้ใน DNA จุลินทรีย์ในปริมาณต่ำมากในวัสดุชีวภาพ
• ซึ่งได้รับการทดสอบแล้ว (ความไว)

การวิเคราะห์ PCR: ราคาและเงื่อนไข

ราคาของการวิเคราะห์เฉพาะจะขึ้นอยู่กับการติดเชื้อที่คุณจะได้รับการทดสอบ ราคาและเงื่อนไขโดยประมาณ:

1. STI: 300-500 rubles เงื่อนไข - 1 วัน;
2. ไวรัส Epstein-Barr, papillomavirus ของมนุษย์, เริม, cytomegalovirus: 300-500 rubles, เงื่อนไข - 1 วัน;
3. ไวรัสตับอักเสบ A, B, C, D, G: การวิเคราะห์เชิงคุณภาพ 650 rubles การวิเคราะห์เชิงปริมาณ 2,000 rubles เงื่อนไข - สูงสุด 5 วัน;
4. แอนติบอดีต่อไวรัสตับอักเสบซีรวม (Anti-HCV) - 420 รูเบิล;
5. แอนติบอดีต่อไวรัสตับอักเสบซี, IgM (Anti-HCV IgM) - 420 รูเบิล;
6. เฮลิโคแบคเตอร์ ไพโลไร ( เชื้อเฮลิโคแบคเตอร์ ไพโลไร): 300-400 rubles เงื่อนไข - 1 วัน;
7. เอชไอวี (แอนติบอดีและแอนติเจน) - 380 รูเบิล;
8. HIV RNA ในเชิงคุณภาพ - 3,500 rubles;
9. HIV RNA ในเชิงปริมาณ - 11,000 rubles

เพื่อประหยัดเงิน คุณสามารถเลือกแพ็คเกจการวิเคราะห์แบบตายตัวได้ บริการนี้จัดทำโดยคลินิกส่วนใหญ่ ซึ่งคุณสามารถทำการวิเคราะห์โดยใช้วิธี PRC (ในหลอดทดลอง ออนคลินิก ฯลฯ)