ПРИНЦИП НА МЕТОДА (молекулярно-биологична основа)

Сред голямото разнообразие от хибридизационни методи за ДНК анализ, PCR е най-широко използваният в клиничната лабораторна диагностика.

Принцип на метода полимеразна верижна реакция (PCR)(Полимеразна верижна реакция (PCR)) е разработена от Кери Мълис (Cetus, САЩ) през 1983 г. и сега се използва широко за научно изследване, и за диагностика в практическото здравеопазване и службата на Държавния санитарно-епидемиологичен надзор (генотипиране, диагностика на инфекциозни заболявания).

PCR методът се основава на естествен процес - комплементарно завършване на ДНК шаблона, извършено с помощта на ензима ДНК полимераза. Тази реакция се нарича ДНК репликация.

Естествената репликация на ДНК включва няколко стъпки:

1) Денатурация на ДНК(развиване на двойната спирала, дивергенция на ДНК вериги);

2) Образуване на къси двуверижни ДНК сегменти(семена, необходими за иницииране на синтеза на ДНК);

3) Синтез на нова ДНК верига(допълнително завършване на двете направления)

Този процесможе да се използва за правене на копия къси сегменти от ДНК, специфични за специфични микроорганизми,тези. да се извърши целенасочено търсене на такива специфични области, което е цел на генната диагностика за идентифициране на патогени на инфекциозни заболявания.

Откриване на термостабилна ДНК полимераза (Taq полимераза) от термофилни бактерии Thermis aquaticus, чийто оптимум е в района на 70-72°C, направи възможно процеса на репликация на ДНК да бъде цикличен и да се използва за работа in vitro. Създаването на програмируеми термостати (усилватели), които по зададена програма извършват циклична промяна на температурата, създаде предпоставките за широкото въвеждане на PCR метода в практиката на лабораторната клинична диагностика. При многократно повторение на циклите на синтез настъпва експоненциално увеличаване на броя на копията на специфичен ДНК фрагмент, което дава възможност да се получи достатъчен брой ДНК копия от малко количество от анализирания материал, който може да съдържа единични клетки на микроорганизми , за идентифицирането им чрез електрофореза.

Допълнителното завършване на веригата не започва в нито една точка от ДНК последователността, а само в определени изходни блокове – къси двуверижни участъци. Чрез прикрепване на такива блокове към специфични области на ДНК е възможно да се насочи процеса на синтез на нова верига само в този регион, а не по цялата дължина на ДНК веригата. За създаване на стартови блокове в дадени ДНК региони се използват два олигонуклеотидни праймера (20 нуклеотидни двойки), наречени грундове.Праймерите са комплементарни на ДНК последователностите на лявата и дясната граница на специфичен фрагмент и са ориентирани по такъв начин, че завършването на нова ДНК верига се случва само между тях.

По този начин PCR е многократно увеличаване на броя на копията (амплификация) на специфична ДНК област, катализирана от ензима ДНК полимераза.

За усилване са необходими следните компоненти:

Смес от дезоксинуклеотидни трифосфати (dNTPs)(смес от четири dNTPs, които са материалът за синтеза на нови комплементарни ДНК вериги)

Ензим Taq полимераза(термостабилна ДНК полимераза, която катализира удължаването на праймерните вериги чрез последователно добавяне на нуклеотидни бази към растяща верига от синтезирана ДНК).

буферен разтвор(реакционна среда, съдържаща Mg2+ йони, необходими за поддържане на ензимната активност)
За да се определят специфични региони на генома на РНК-съдържащи вируси, първо се получава ДНК копие от РНК шаблон, като се използва реакция на обратна транскрипция (RT), катализирана от ензима обратна транскриптаза (обратна транскриптаза).

За да се получи достатъчен брой копия на желания характерен ДНК фрагмент, амплификацията включва няколко (20-40) цикъла.

Всеки цикъл на усилване включва 3 етапа, протичащи при различни температурни условия Стъпка 1: Денатурация на ДНК(развиване на двойна спирала). Тече при 93-95°C за 30-40 секунди. Етап 2: Закрепване на грундове (отгряване).Прикрепването на праймера се осъществява комплементарно към съответните последователности на противоположни ДНК вериги по границите на специфично място. Всяка двойка праймери има своя собствена температура на отгряване, чиито стойности са в диапазона 50-65°C. Време за отгряване -20-60 сек. Етап 3: Изграждане на ДНК вериги.Допълнителното завършване на ДНК веригите става от 5'-края до 3'-края на веригата в противоположни посоки, като се започне от местата на прикрепване на праймера. Материалът за синтеза на нови ДНК вериги са дезоксирибонуклеотидни трифосфати (dNTPs), добавени към разтвора. Процесът на синтез се катализира от ензима термостабилна ДНК полимераза (Taq полимераза) и протича при температура 70-72°C. Време за синтез - 20-40 сек.

Новите ДНК вериги, образувани в първия цикъл на амплификация, служат като шаблони за втория цикъл на амплификация, в който се образува желаният специфичен ДНК фрагмент (ампликон). (виж фиг. 2). В следващите цикли на усилване ампликоните служат като шаблон за синтеза на нови вериги. По този начин натрупването на ампликони в разтвор става съгласно формулата 2n, където n е броят на циклите на усилване. Следователно, дори ако първоначално имаше само една двуверижна ДНК молекула в първоначалния разтвор, около 108 ампликонови молекули се натрупват в разтвора след 30-40 цикъла. Това количество е достатъчно за надеждно визуално откриване на този фрагмент чрез електрофореза в агарозен гел. Процесът на усилване се извършва в специален програмируем термостат (усилвател), който по зададена програма автоматично променя температурите според броя на циклите на усилване.

ЕТАПИ НА PCR - АНАЛИЗ

Методът PCR, като инструмент за лабораторна диагностика на инфекциозни заболявания, се основава на откриването на малък ДНК фрагмент на патогена (няколкостотин базови двойки), специфичен само за този микроорганизъм, като се използва полимеразна верижна реакция за натрупване на желания фрагмент .
Техниката за анализ с помощта на PCR метода включва три етапа:

1. Изолиране на ДНК (РНК) от клинична проба

2. Амплификация на специфични ДНК фрагменти
3. Откриване на продукти на усилване

Изолиране на ДНК (РНК)
На този етап от анализа клиничната проба се подлага на специална обработка, която води до лизис на клетъчния материал, отстраняване на протеинови и полизахаридни фракции и приготвяне на разтвор на ДНК или РНК без
инхибитори и готови за по-нататъшно усилване.
Изборът на техника за извличане на ДНК (РНК) се определя основно от естеството на обработвания клиничен материал.

Амплификация на специфични ДНК фрагменти
На този етап се натрупват къси специфични ДНК фрагменти в количеството, необходимо за тяхното по-нататъшно откриване. Повечето методи за определяне на специфични фрагменти от генома използват т.нар. „Класическа версия на управлявана PCR. За да се повиши специфичността и чувствителността на анализа, някои методи използват „вложен” PCR метод, който използва 2 двойки праймери („външни” - за 1-ви етап и „вътрешни” - за 2-ри етап).

Откриване на продукти на усилване
В повечето техники на този етап сместа от продукти на амплификация, получена на втория етап, се разделя чрез електрофореза с хоризонтален агарозен гел. Преди електрофоретичното разделяне към сместа за амплификация се добавя разтвор на етидиев бромид, който образува силни интерстициални връзки с двойноверижни ДНК фрагменти. Тези съединения под действието на UV облъчване са способни да флуоресцират, което се записва като оранжево-червени светещи ленти след електрофоретично разделяне на амплифициращата смес в агарозен гел.

Като алтернатива на метода за електрофоретично откриване, който има някои недостатъци: субективност при разчитането на резултатите, ограничения за определяне на ДНК на различни микроорганизми в една реакция, могат да бъдат предложени. схеми за откриване на хибридизация.В тези схеми ДНК фрагментът, получен в резултат на амплификацията, хибридизира (образува 2-верижни комплекси - "хибриди") със специфична олигонуклеотидна сонда. Регистрирането на такива комплекси може да се извърши колориметрично или флуориметрично. НПК "Литех" създаде комплекти за откриване на базата на хибридизация с флуориметрична регистрация на резултатите

ПРЕДИМСТВА НА PCR МЕТОДА като метод за диагностициране на инфекциозни заболявания:

- Директно откриване на наличието на патогени

Много традиционни диагностични методи, като ензимно-свързан имуносорбентен анализ, откриват маркерни протеини, които са отпадъчни продукти на инфекциозни агенти, които предоставят само косвено доказателство за наличието на инфекция. Идентифицирането на специфична ДНК област на патогена чрез PCR дава директна индикация за наличието на инфекциозния агент.

- Висока специфичност
Високата специфичност на PCR метода се дължи на факта, че в тестовия материал се открива уникален ДНК фрагмент, характерен само за този патоген. Специфичността се определя от нуклеотидната последователност на праймерите, която изключва
възможността за получаване на фалшиви резултати, за разлика от метода на ензимния имуноанализ, където грешките не са необичайни поради кръстосано реагиращи антигени.

- Висока чувствителност
PCR методът ви позволява да откриете дори единични клетки от бактерии или вируси. PCR диагностиката открива наличието на патогени на инфекциозни заболявания в случаите, когато други методи (имунологични, бактериологични,
микроскопично) е невъзможно. Чувствителността на PCR анализа е 10-1000 клетки на проба (чувствителността на имунологичните и микроскопските тестове е 103-105 клетки).

-Универсалност на процедурата за идентифициране на различни патогени
Материалът за изследване чрез PCR е ДНК на патогена. Методът се основава на откриване на ДНК или РНК фрагмент, който е специфичен за конкретен организъм. сходство химичен съставна всички нуклеинови киселини позволява използването на унифицирани методи за лабораторни изследвания. Това прави възможно диагностицирането на няколко патогена от един биологичен анализ. Като материал за изследване могат да се използват различни биологични секрети (слуз, урина, храчки), остъргвания от епителни клетки, кръв, серум.

- Висока скорост на получаване на резултата от анализа
PCR анализът не изисква изолиране и култивиране на културата на патогена, което отнема много време. Единен метод за обработка на биоматериали и откриване на реакционни продукти, както и автоматизация на процеса на амплификация дават възможност за извършване на пълен анализ за 4-4,5 часа.

Трябва да се отбележи, че PCR методът може да открие патогени не само в клиничния материал, получен от пациента, но и в материала, получен от обектите. външна среда(вода, почва и др.)

ПРИЛОЖЕНИЕ НА PCR МЕТОДА В ПРАКТИЧЕСКОТО ЗДРАВЕОПАЗВАНЕ

Използването на PCR метода за диагностициране на инфекциозни заболявания както от бактериална, така и от вирусна природа е от голямо значение за решаването на много проблеми на микробиологията и епидемиологията. Използването на този метод също допринася за развитието фундаментални изследванияв областта на хроничните и недостатъчно проучени инфекциозни заболявания.

Най-ефективното и икономически оправдано използване на метода при:

урогинекологична практика- за откриване на хламидия, уреаплазмоза, гонорея, херпес, гарднерелоза, микоплазмена инфекция;

в пулмологията- за диференциална диагнозавирусна и бактериална пневмония, туберкулоза;

в гастроентерологията- за откриване на хеликобактериоза;

в клиниката по инфекциозни болести- като експресен метод за диагностика на салмонелоза, дифтерия, вирусна хепатит В, Си G;

в хематологията- за откриване на цитомегаловирусна инфекция, онковируси.

В края на статията вж
Полимеразна верижна реакция (PCR, PCR)изобретен през 1983 г. от Кери Мълис (американски учен). Впоследствие той получи Нобелова награда за това изобретение. В момента PCR диагностиката е един от най-точните и чувствителни методи за диагностициране на инфекциозни заболявания.
Полимеразна верижна реакция (PCR)- експериментален метод на молекулярната биология, метод за значително увеличаване на малки концентрации на определени фрагменти от нуклеинова киселина (ДНК) в биологичен материал (проба).
PCR методът се основава на многократно удвояване на определен участък от ДНК с помощта на ензими при изкуствени условия (in vitro). В резултат на това се произвеждат достатъчни количества ДНК за визуално откриване. В този случай се копира само областта, която отговаря на посочените условия, и то само ако присъства в изследваната извадка.
В допълнение към простото увеличаване на броя на ДНК копията (този процес се нарича амплификация), PCR позволява много други манипулации с генетичен материал (въвеждане на мутации, сплайсинг на ДНК фрагменти) и се използва широко в биологичната и медицинска практика, напр. за диагностициране на заболявания (наследствени, инфекциозни), за установяване на бащинство, за клониране на гени, въвеждане на мутации, изолиране на нови гени.

Специфика и приложение

Провеждане на PCR

За PCR, в най-простия случай, са необходими следните компоненти:

• ДНК шаблон, съдържащ участъка от ДНК, който трябва да бъде амплифициран;
• два праймера, комплементарни към краищата на желания фрагмент;
• термостабилна ДНК полимераза;
• дезоксинуклеотидни трифосфати (A, G, C, T);
• Mg2+ йони, необходими за действието на полимераза;
• буферен разтвор.

PCR се извършва в усилвател - устройство, което осигурява периодично охлаждане и нагряване на епруветките, обикновено с точност от най-малко 0,1 ° C. За да се избегне изпаряването на реакционната смес, към епруветката се добавя висококипящо масло, като вазелин. Добавянето на специфични ензими може да увеличи добива на PCR реакцията.
Напредък на реакцията

Обикновено при провеждане на PCR се извършват 20 - 35 цикъла, всеки от които се състои от три етапа. Двуверижната ДНК матрица се нагрява до 94 - 96°C (или 98°C, ако се използва особено термостабилна полимераза) за 0,5 - 2 минути, за да се даде възможност на ДНК нишките да се разделят. Този етап се нарича денатурация – разрушават се водородните връзки между двете вериги. Понякога, преди първия цикъл, реакционната смес се загрява предварително за 2-5 минути, за да денатурира напълно шаблона и праймерите.
Когато нишките се разделят, температурата се понижава, за да се позволи на праймерите да се свържат с едноверижния шаблон. Този етап се нарича отгряване. Температурата на отгряване зависи от праймерите и обикновено се избира 4 - 5°C под тяхната точка на топене. Време за етап - 0,5 - 2 минути.

ДНК полимераза репликира шаблонната верига, използвайки праймера като праймер. Това е етапът на удължаване. Температурата на удължаване зависи от полимеразата. Често използваните полимерази са най-активни при 72°C. Времето на удължаване зависи както от вида на ДНК полимеразата, така и от дължината на фрагмента, който се амплифицира. Обикновено времето за удължаване се приема за една минута за всеки хиляда базови двойки. След края на всички цикли често се извършва допълнителен етап на окончателно удължаване, за да се завършат всички едноверижни фрагменти. Този етап продължава 10-15 минути.
Подготовка на материал за изследване и транспортирането му до лабораторията

За успешен анализ е важно правилно да се събере материалът от пациента и да се подготви правилно. Известно е, че при лабораторната диагностика по-голямата част от грешките (до 70%) се допускат на етапа на подготовката на пробите. За вземане на кръв в лаборатория INVITRO в момента се използват вакуумни системи, които, от една страна, минимално нараняват пациента, а от друга страна позволяват вземането на материала по такъв начин, че да не влиза в контакт. с персонала или с околната среда. Така се избягва замърсяването (замърсяването) на материала и се гарантира обективността на PCR анализа.

ДНК - дезоксирибонуклеинова киселина - биологичен полимер, един от двата вида нуклеинови киселини, които осигуряват съхранение, предаване от поколение на поколение и изпълнение на генетичната програма за развитие и функциониране на живите организми. Основната роля на ДНК в клетките е дългосрочното съхранение на информация за структурата на РНК и протеините.

РНК-рибонуклеиновата киселина е биологичен полимер, подобен по своята същност химическа структуракъм ДНК. Молекулата на РНК е изградена от същите мономерни единици – нуклеотиди като ДНК. В природата РНК обикновено съществува като единична верига. При някои вируси РНК е носител на генетична информация. В клетката той играе важна роля в трансфера на информация от ДНК към протеин. РНК се синтезира върху ДНК шаблон. Този процес се нарича транскрипция. Има секции в ДНК, които съдържат информация, отговорна за синтеза на три вида РНК, които се различават по своите функции: информационна или информационна РНК (иРНК), рибозомна (рРНК) и транспортна (тРНК). И трите вида РНК участват по един или друг начин в протеиновия синтез. Информацията за протеиновия синтез обаче се съдържа само в иРНК.

Нуклеотидите са основната повтаряща се единица в молекулите на нуклеиновите киселини, продукт на химично съединение на азотна основа, петвъглеродна захар (пентоза) и една или повече фосфатни групи. Нуклеотидите, присъстващи в нуклеиновите киселини, съдържат една фосфатна група. Наименуват се според съдържащата се в тях азотна основа - аденин (А) съдържащ аденин, гуанин (G) - гуанин, цитозин (С) - цитозин, тимин (Т) - тимин, урацил (U) - урацил. ДНК се състои от 4 вида нуклеотиди - A, T, G, C, RNA също има 4 вида - A, U, G, C. Захарта в състава на всички ДНК нуклеотиди е дезоксирибоза, РНК е рибоза. При образуването на нуклеинови киселини нуклеотидите чрез свързване образуват захарно-фосфатен гръбнак на молекулата, от едната страна на който има основи.

Праймерът е къса ДНК, използвана за репликиране на шаблонната верига. Всеки от праймерите е комплементарен към една от веригите на двуверижния шаблон, оформяйки началото и края на амплифицирания регион.

литература

1. Glik B., Pasternak J. Молекулярна биотехнология. Принципи и приложение. Пер. от английски. - М.: Мир, 2002. - 589 с., ил. ISBN 5-03-003328-9
2. Шчелкунов S.N. Генно инженерство - Новосибирск: Сиб. унив. изд., 2004. - 496 с.; аз ще. ISBN 5-94087-098-8
3. Патрушев L.I. Изкуствени генетични системи - М .: Наука, 2005 - В 2 тома - ISBN 5-02-033278-X

ВАЖНО!

Информацията в този раздел не трябва да се използва за самодиагностика или самолечение. В случай на болка или друго обостряне на заболяването, само лекуващият лекар трябва да предпише диагностични изследвания. За диагноза и правилно лечение трябва да се свържете с Вашия лекар.

Полимеразна верижна реакция (PCR)

Същността на PCR метода. ДНК полимераза

Полимеразната верижна реакция е експериментален метод на молекулярната биология, който позволява да се постигне значително увеличение на малки концентрации на определени фрагменти от нуклеинова киселина в биологичен материал. Този процес на увеличаване на броя на копията на ДНК се нарича усилване. Копирането на ДНК по време на PCR се извършва от специален ензим - полимераза.ДНК полимеразата (фиг. 3) е ензим, участващ в репликацията (амплификацията на ДНК в живите организми) на ДНК. Ензимите от този клас катализират полимеризацията на дезоксирибонуклеотиди по протежение на ДНК нуклеотидната верига, която ензимът "чете" и използва като шаблон. Типът на нов нуклеотид се определя от принципа на комплементарност с шаблона, от който се извършва отчитането.

ДНК полимеразата добавя свободни нуклеотиди към 3 "края на сглобената верига. Това води до удължаване на веригата в посока 5"-3. Нито една от известните ДНК полимерази не е в състояние да създаде верига "от нулата": те са може само да добавя нуклеотиди към вече съществуваща 3"-хидроксилна група. Поради тази причина се нуждае от ДНК полимераза грунд- кратка последователност от нуклеотиди (обикновено 20-25), комплементарна на крайните участъци на изследвания ген - към която тя може да добави първия нуклеотид. Праймерите винаги са съставени от ДНК и РНК бази, като първите две бази винаги са РНК бази. Праймерите се синтезират от друг ензим - примаза. Друг ензим е хеликаза- необходими за развиването на двойната спирала на ДНК с образуването на едноверижна структура, която осигурява репликацията на двете вериги в съответствие с полуконсервативния модел на репликация на ДНК.

Някои ДНК полимерази също имат способността да коригират грешки в новосглобената ДНК верига. Ако се открие неправилна двойка нуклеотиди, ДНК полимеразата се връща назад, премахва грешния нуклеотид от веригата, след което вмъква правилния на негово място, след което репликацията продължава както обикновено.

Провеждане на PCR

Полимеразната верижна реакция (PCR) е метод за амплификация на ДНК, който може да изолира и размножи специфична ДНК последователност милиарди пъти в рамките на няколко часа. Възможността за получаване на огромен брой копия на един строго определен регион на генома значително опростява изследването на съществуваща ДНК проба.

За да се осъществи полимеразната верижна реакция, трябва да бъдат изпълнени редица условия. За PCR, в най-простия случай, са необходими следните компоненти:

ДНК шаблон, съдържащ участъка от ДНК, който трябва да бъде амплифициран.

Два праймера, комплементарни към краищата на желания фрагмент. (Двойка изкуствено синтезирани олигонуклеотиди, обикновено с размер от 15 до 30 bp, идентични със съответните региони на целевата ДНК. Те играят ключова роля при образуването на продукти на реакцията на амплификация. Правилно подбраните праймери гарантират специфичността и чувствителността на теста система.)

Термостабилна ДНК полимераза. Полимеразата, използвана в PCR, трябва да остане активна при висока температураза дълго време се използват ензими, изолирани от термофили - Thermus aquaticus (Taq-полимераза) и др.

Дезоксинуклеотидни трифосфати (dATP, dGTP, dCTP, dTTP).

Mg 2+ йони, необходими за работа на полимеразата.

Буферен разтвор, който осигурява необходимите условия за реакция – pH, йонна сила на разтвора. Съдържа соли, серумен албумин.

За да се избегне изпаряването на реакционната смес, към епруветката се добавя висококипящо масло, като вазелин. Ако се използва устройство с нагряван капак, това не се изисква.

Добавянето на пирофосфатаза може да увеличи добива от PCR реакцията. Този ензим катализира хидролизата на пирофосфат, страничен продукт от добавянето на нуклеотидни трифосфати към растящата ДНК верига, към ортофосфат. Пирофосфатът може да инхибира PCR реакцията.

За да се умножи броят на копията на оригиналната ДНК, е необходима циклична реакция. По правило всеки от последователно повтарящите се PCR цикли се състои от три етапа:

1. Денатурация или "топене" на ДНК.Двуверижната ДНК матрица се нагрява до 94 - 96°C (или 98°C, ако се използва особено термостабилна полимераза) за 0,5 - 2 минути, за да се даде възможност на ДНК нишките да се разделят. Тази стъпка се нарича денатурация, тъй като водородните връзки между двете вериги на ДНК са скъсани. Понякога, преди първия цикъл (преди добавяне на полимераза), реакционната смес се загрява предварително за 2-5 минути, за да се денатурира напълно шаблонът и праймерите. Този подход се нарича горещ старт, позволява да се намали количеството на неспецифичните реакционни продукти.

2. Отгряване - свързване на праймерите към матрицата ДНК. След като нишките се разделят, температурата бавно се понижава, за да позволи на праймерите да се свържат с едноверижния шаблон. Температурата на отгряване зависи от състава на грунда и обикновено се избира при 50–65°C. Времетраене на етапа - 20 - 60 секунди. Неправилен избор на температура на отгряване води или до лошо свързване на праймерите към шаблона (при повишена температура) или до свързване на грешно място и поява на неспецифични продукти (при ниска температура).

3. Синтез (удължаване на веригата).ДНК полимераза репликира шаблонната верига, използвайки праймера като "семе". Полимеразата започва синтеза на втората нишка от 3" края на праймера, който се е свързал с шаблона и се движи по протежение на шаблона. Температурата на удължаване зависи от полимеразата. Често използваните Taq и Pfu полимерази са най-активни при 72 °C дължината на фрагмента, който трябва да се амплифицира Обикновено времето за удължаване се приема за една минута за всеки хиляда базови двойки След като всички цикли са завършени, често се извършва допълнителна стъпка окончателно удължаванеза завършване на всички едноверижни фрагменти. Този етап продължава 7-10 минути.

Впоследствие етапите на денатурация, отгряване и удължаване се повтарят многократно (30 или повече пъти). При всеки цикъл броят на синтезираните копия на ДНК фрагмент се удвоява.

Всички реакции се провеждат в епруветки, потопени в термостат. Промяната на температурния режим и неговата поддръжка се извършват автоматично.

За да се разбере как точно се случва амплификацията на определен ДНК сегмент по време на PCR, е необходимо ясно да се разбере позицията на всички праймери и техните комплементарни последователности в амплифициращите се вериги във всеки кръг. В първия кръг всяка от новосинтезираните вериги е много по-дълга от разстоянието от 3"-хидроксилната група на нейния праймер до крайния нуклеотид на последователността, комплементарна на втория праймер. Такива вериги се наричат ​​"дълги шаблони", т.е. върху тях ще се извърши по-нататъшен синтез.

Във втория кръг, двуверижна ДНК, състояща се от подобни и новосинтезирани (дълги шаблонни) вериги, отново се денатурира и след това се отгрява с праймери. По време на синтеза в този кръг отново се синтезират "дълги шаблони", както и редица нишки с праймер в единия край и с последователност, комплементарна на втория праймер в другия ("къси шаблони"). По време на третия кръг всички хетеродуплекси, образувани по-рано, се денатурират едновременно и се отгряват с праймери и след това се репликират. В следващите кръгове има все повече "къси матрици", а към 30-ия кръг техният брой вече е 10 6 пъти по-голям от броя на първоначалните вериги или "дълги матрици".

Количеството специфичен реакционен продукт (ограничено от праймери) теоретично нараства пропорционално на 2 n , където n е броят на реакционните цикли. Всъщност ефективността на всеки цикъл може да бъде по-малка от 100%, така че в действителност:

където P е количеството продукт, E е средната ефективност на цикъла.

Броят на "дългите" ДНК копия също нараства, но линейно, така че специфичен фрагмент доминира в продуктите на реакцията. Растежът на необходимия продукт е експоненциално ограничен от количеството реагенти, наличието на инхибитори и образуването на странични продукти.

PCR е силно чувствителен метод, следователно, ако има дори незначително количество ДНК в тестовата проба, която случайно е попаднала от една реакционна смес в друга, могат да се получат фалшиво положителни резултати. Това налага внимателното контролиране на всички разтвори и прибори, използвани за PCR.

Основни принципи за избор на грунд.

При създаването на PCR тестова система една от основните задачи е правилният избор на праймери, които трябва да отговарят на редица критерии:

1. Грундовете трябва да са специфични. Особено внимание се обръща на 3" края на праймерите, тъй като именно от тях Taq полимеразата започва да завършва комплементарната ДНК верига. Ако тяхната специфичност е недостатъчна, тогава най-вероятно ще възникнат нежелани процеси в епруветката с реакционната смес , а именно синтеза на неспецифична ДНК (къси или дълги фрагменти). Вижда се при електрофореза под формата на тежки или леки допълнителни ленти. Това затруднява оценката на резултатите от реакцията, тъй като е лесно да се обърка специфичен продукт за амплификация със синтезирана чужда ДНК. Някои праймери и dNTP се консумират за синтеза на неспецифична ДНК, което води до значителна загуба на усещане.

2. Праймерите не трябва да образуват димери и бримки, т.е. не трябва да се образуват стабилни двойни нишки чрез отгряване на праймерите към себе си или един към друг.

SEI HPE „Красноярска държавна медицинска академия

на името на Федералната агенция за здравеопазване и социално развитие Ясенецки »

Катедра по медицинска генетика и клинична неврофизиология, IPO

ОСНОВНИ ПРИНЦИПИ НА МЕТОДА

ПОЛИМЕРАЗНА ВЕРИЖНА РЕАКЦИЯ

Методическо ръководство за студенти от 3-4 курса

в специалностите обща медицина (060101) и

Красноярск - 2007г

Шнайдер, Н. А., Бутянов, Р. А. Основни принципи на метода на полимеразна верижна реакция. Методическо ръководство за извънкласна работа на студенти от 3-4 курса по специалностите обща медицина (060101) и педиатрия (060103). - Красноярск: Издателство на GOU VPO KrasGMA, 2007. - 42с.

Методическото ръководство напълно отговаря на изискванията на Държавния стандарт (2000) и отразява основните аспекти съвременен методдиагностика на човешки наследствени заболявания - методът на полимеразната верижна реакция, учебният материал е адаптиран към образователните технологии, като се отчита спецификата на обучение в 3-4 курса на медицински и педиатрични факултети.

Рецензенти:Ръководител на катедра „Медицинска генетика”, Държавно висше професионално образование

"Новосибирски държавен медицински университет на Федералната агенция за здраве и социално развитие", доктор на медицинските науки, професор;

ДНК репликация

Обект на изследване на този метод е Дезоксирибонуклеинова киселина (ДНК). ДНК е универсален носител на генетична информация във всички организми, съществуващи на Земята (с изключение на РНК-съдържащите микроорганизми). ДНК е двойна верига, усукана в спирала. Всяка верига се състои от нуклеотиди, свързани последователно. ДНК вериги имат обратна посока: 5'-краят на една верига съответства на 3'-края на втората верига. Уникалното свойство на ДНК е способността й да се дублира. Този процес се нарича репликация. Репликацията на ДНК молекулата се случва по време на синтетичния период на интерфазата. Всяка от двете вериги на "родителската" молекула служи като шаблон за "дъщерята". След репликация, новосинтезираната ДНК молекула съдържа една "майчина" верига, а втората - "дъщеря", новосинтезирана (полуконсервативен метод). За синтеза на матрица на нова ДНК молекула е необходимо старата молекула да бъде деспирализирана и разтегната. Репликацията започва на няколко места в молекулата на ДНК. Секцията на ДНК молекула от началото на една репликация до началото на друга се нарича репликон.

Стартът на репликацията е активиран грундове(семена), състоящи се от 100-200 базови двойки. Ензимът ДНК хеликаза се развива и разделя изходната ДНК спирала на две вериги, върху които, съгласно принципа на комплементарност, с участието на ензима ДНК полимераза, се сглобяват „дъщерни“ ДНК вериги. За да може ензимът да започне своята работа, е необходимо наличието на стартов блок - малък първоначален двуверижен фрагмент. Началният блок се образува, когато праймерът взаимодейства с комплементарния регион на съответната верига на родителската ДНК. Във всеки репликон ДНК полимеразата може да се движи по протежение на "майчината" верига само в една посока (5`=>3`).

На водещата нишка, докато репликонът се развива, „дъщерната“ нишка постепенно расте непрекъснато. Върху изоставащата верига дъщерната верига също синтезира в посока (5`=>3`), но на отделни фрагменти, докато репликонът се развива.

По този начин прикрепването на комплементарни нуклеотиди на "дъщерните" вериги върви в противоположни посоки (антипаралелно). Репликацията във всички репликони се извършва едновременно. Фрагменти и части от "дъщерни" вериги, синтезирани в различни репликони, се лигират в една верига от ензимна лигаза. Репликацията се характеризира с полуконсервация, антипаралелизъм и прекъсване. Целият геном на клетката се репликира веднъж на период от време, съответстващ на един митотичен цикъл. В резултат на процеса на репликация от една ДНК молекула се образуват две ДНК молекули, в които едната верига е от родителската ДНК молекула, а втората, дъщерната, е новосинтезирана (фиг. 1).

Ориз. един. Диаграма на репликация на ДНК молекула.

По този начин цикълът на репликация на ДНК включва три основни етапа:

1. развиване на спиралата на ДНК и дивергенция на нишките (денатурация);

2. закрепване на грундове;

3. завършване на веригата на детската нишка.

Принцип на PCR метода

Именно репликацията на ДНК формира основата на PCR. При PCR изброените по-горе процеси се извършват в епруветка в цикличен режим. Преходът от един етап на реакцията към друг се постига чрез промяна на температурата на инкубационната смес. Когато разтворът се нагрява до 93-95°C, настъпва денатурация на ДНК. За да се премине към следващата стъпка - добавяне или "отгряване" на праймери - инкубационната смес се охлажда до 50-65°C. След това сместа се загрява до 70-72°C - оптималната работа на taq-ДНК полимераза - на този етап се завършва нова ДНК верига. След това цикълът се повтаря отново. С други думи PCR методът е многократно увеличаване на броя на копията (усилване) специфичен участък от ДНК, катализиран от ензима ДНК полимераза.

Удължаването на дъщерните ДНК вериги трябва да се случи едновременно на двете вериги на майчината ДНК, така че репликацията на втората верига също изисква собствен праймер. Така в реакционната смес се въвеждат два праймера: един за "+"-веригата, вторият за "-"-веригата. След като се присъединят към противоположните вериги на молекулата на ДНК, праймерите се ограничават до тази част от нея, която впоследствие ще бъде многократно удвоена или амплифицирана. Дължината на такъв фрагмент, който се нарича ампликон, обикновено е няколкостотин нуклеотида.

PCR стъпки

Всеки цикъл на усилване включва 3 етапа, протичащи при различни температурни условия (фиг. 2).

· Етап 1:Денатурация на ДНК . Тече при 93-95° за 30-40 секунди.

· Етап 2:грунд отгряване . Прикрепването на праймера се осъществява комплементарно към съответните последователности на противоположни ДНК вериги по границите на специфичен регион. Всяка двойка праймери има своя собствена температура на отгряване, чиито стойности са в диапазона 50-65°C. Време за отгряване 20-60 сек.

· Етап 3:удължаване на ДНК вериги. Допълнителното удължаване на ДНК веригите става от 5" края до 3" края на веригата в противоположни посоки, като се започне от местата на прикрепване на праймера. Материалът за синтеза на нови ДНК вериги са дезоксирибонуклеозид трифосфати, добавени към разтвора. Процесът на синтез се катализира от ензима taq-полимераза и протича при температура 70-72°C. Време за синтез - 20-40 сек.

Новите ДНК вериги, образувани в първия цикъл на амплификация, служат като шаблони за втория цикъл на амплификация, в който се образува специфичен ампликонен ДНК фрагмент (фиг. 3). В следващите цикли на усилване ампликоните служат като шаблон за синтеза на нови вериги.

По този начин ампликоните се натрупват в разтвора по формула 2", където n е броят на циклите на амплификация. Следователно, дори ако първоначално в първоначалния разтвор е била само една двуверижна ДНК молекула, около 108 ампликонови молекули се натрупват в разтвора в 30-40 цикъла Това количество е достатъчно за надеждно визуално откриване на този фрагмент чрез електрофореза в агарозен гел.

Процесът на усилване се извършва в специален програмируем термостат ( велосипедист), който според дадена програма автоматично променя температурите според броя на циклите на усилване.

За усилване са необходими следните компоненти:

· ДНК шаблон(ДНК или нейната част, съдържаща желания специфичен фрагмент);

· Грундове(синтетични олигонуклеотиди (20-30 нуклеотидни двойки), комплементарни на ДНК последователности на границите на специфичния фрагмент, който се определя). Изборът на специфичен фрагмент и изборът на праймери играят основна роля в специфичността на амплификацията, което влияе върху качеството на анализа.

· Смес от дезоксинуклеотидни трифосфати (dNTPs)(смес от четири dNTP, които са материалът за синтеза на нови комплементарни ДНК вериги в еквивалентни концентрации от 200-500 микрона)

· ЕнзимTaq-полимераза(термостабилна ДНК полимераза, катализираща удължаването на праймерните вериги чрез последователно добавяне на нуклеотидни бази към растящата верига от синтезирана ДНК, 2-3 mm).

· буферен разтвор(реакционна среда, съдържаща Mg2+ йони, необходими за поддържане на ензимната активност, PH 6,8-7,8).

За да се определят специфични региони на генома на РНК вирусите, първо се получава ДНК копие от РНК шаблон, като се използва реакция на обратна транскрипция (RT), катализирана от ензима обратна транскриптаза (обратна транскриптаза).

Ориз. 2. Усилване (1-ви цикъл).

Ориз. 3. Усилване (2-ри цикъл).

Основни приложения на PCR

клинична медицина:

o диагностика на инфекции,

o откриване на мутации, включително диагностициране на наследствени заболявания,

o генотипиране, включително HLA генотипиране,

o клетъчни технологии

екология (като начин за наблюдение на състоянието и качеството на обектите заобикаляща средаи храна)

определение за трансгенни организми (ГМО)

Лична идентификация, бащинство, криминалистика

обща и частна биология,

Основни принципи

организация на диагностични лаборатории

Работата в PCR лабораторията се извършва в съответствие с „Правилата за проектиране, безопасност, производствена санитария, противоепидемичен режим и лична хигиена при работа в лаборатории (отделения, отдели) на санитарно-епидемиологичните институции на системата на здравеопазването.

Замърсяване на ДНК проби

Извършването на PCR диагностика е свързано с проблем, причинен от високата чувствителност на метода – възможността замърсяване. Ако следи от положителна ДНК попаднат в реакционната епруветка (специфични продукти на амплификация на ДНК - ампликони; ДНК стандарт, използван като положителна контрола; положителна ДНК на клинична проба) води до амплификация на специфичен ДНК фрагмент по време на PCR и в резултат на това до появата на фалшиви положителни резултати.

По време на работа може да се срещнете два вида замърсяване:

1. кръстосано замърсяванеот проба до проба (по време на обработка на клинични проби или при изкопаване на реакционната смес), което води до появата на спорадични фалшиво положителни резултати;

2. замърсяване на продукта за усилване(ампликони) имащи най-висока стойност, тъй като по време на PCR процеса ампликоните се натрупват в огромни количества и са идеални продукти за повторно амплифициране.

Следи от замърсяване с ампликон на съдове, автоматични пипети и лабораторно оборудване, повърхността на лабораторните маси или дори повърхността на кожата на лабораторните работници води до систематични фалшиво положителни резултати. Определянето на източника на замърсяване може да бъде много трудно и изисква значителна инвестиция на време и пари. Натрупаният до момента опит в работата на лабораториите, използващи PCR метода за диагностика, ни позволява да формулираме основните изисквания за организацията на такива лаборатории и провеждането на самите анализи. Спазването на тези изисквания елиминира възможността от замърсяване и получаване на фалшиво положителни резултати.

Етапи на PCR анализ

Географски разделени, поставяйки ги в отделни помещения (фиг. 4.5):

· стая за предварителна PCR,където се извършва обработка на клинични проби, извличане на ДНК, подготовка на реакционната смес за PCR и PCR (при наличие на условия се препоръчва последните две стъпки също да се извършват в допълнително отделно помещение). В тези помещения е забранено извършването на всякакви други видове работа с изследваните агенти, чиято PCR диагностика се извършва в тази лаборатория.

· стая след PCR,където се извършва откриването на продукти на амплификация. В тази стая могат да се използват други методи за откриване. Желателно е помещението за откриване на продукти на амплификация да бъде разположено възможно най-далеч от стаите за предварителна PCR.

Работните помещения са оборудвани с ултравиолетови лампи с максимално излъчване в района на 260 nm (тип DB-60) със скорост 2,5 W на 1 m3. Лампите са разположени така, че повърхностите на работните маси, оборудването и материалите, с които операторът влиза в контакт по време на PCR анализа, са изложени на директно облъчване. Облъчването се извършва в рамките на 1 час преди началото на работа и в рамките на 1 час след края на работата.

Лаборантите работят в специални лабораторни дрехи, които се сменят при преместване от една стая в друга, и в ръкавици за еднократна употреба. Обработката на дрехи от различни помещения се извършва отделно. Различни служители работят на различни етапи от PCR анализа.

За работа се използват отделни комплекти дозатори, пластмасови и стъклени съдове, лабораторно оборудване, халати и ръкавици, предназначени за различни етапи на анализ и не могат да се прехвърлят от една стая в друга. Оборудването, материалите и инвентарът във всяка стая са съответно етикетирани.

Всички етапи на работа се извършват само с използването на консумативи за еднократна употреба: накрайници за автоматични пипети, епруветки, ръкавици и др. Не забравяйте да смените накрайниците, когато преминавате от проба към проба. Необходимо е да се използват накрайници с аерозолен бариерен филтър, за да се предотврати навлизането на микрокапчици от разтвора в пипетата. Използваните епруветки и накрайници се изхвърлят в специални контейнери или контейнери, съдържащи дезинфекционен разтвор. Клиничните проби се съхраняват отделно от реагентите.

За обработка и почистване на работното място във всяко помещение има памучно-марлеви тампони (салфетки), пинсети, дезинфекционни и инактивиращи разтвори.

В PCR диагностичната лаборатория се изключва работата, свързана с производството (клонирането) и изолирането на рекомбинантни плазмиди, съдържащи ДНК последователности или генни фрагменти на патогени, които са диагностицирани в тази лаборатория.

Събиране на клиничен материал

Изследваният материал за PCR може да бъде остъргвания от епителни клетки, кръв, плазма, серум, плеврална и гръбначно-мозъчна течност, урина, храчки, слуз и други биологични секрети, биопсични проби.

Вземането на проби от материала се извършва в условията на лечебната зала от съответния профил. След вземане на проби, пробите трябва да бъдат отнесени в PCR диагностичната лаборатория възможно най-скоро.

Вземането на проби трябва да се извършва с помощта на стерилни, за предпочитане инструменти за еднократна употреба само в стерилни пластмасови епруветки за еднократна употреба или стъклени епруветки, предварително обработени за един час с хромова смес, старателно измити с дестилирана вода и калцинирани в пещ при температура 150 ° C за 1 час.

Зона за откриване (друг етаж или друга сграда).

Ориз. 4. PCR лабораторен апарат с откриване чрез електрофореза.

Зона за откриване (различен етаж или сграда)

Ориз. 5. PCR лабораторен апарат с флуоресцентна детекция (количествен анализ).

Ориз. 6. Стая за извличане на ДНК.Показана е настолна кутия с бактерицидна лампа.

Ориз. 7. стая за усилване.

Ориз. осем. Стая за откриване.

Ориз. 9. Кръвни проби за ДНК диагностика на наследствени заболявания.

Съхранение и транспортиране на проби

За диагностициране на наследствени заболявания кръвните проби се съхраняват на специални хартиени форми или в епиндорф (пластмасови епруветки) в замразено състояние за продължително време (фиг. 9).

За диагностициране на инфекциозни заболявания пробите се съхраняват при стайна температура за не повече от 2 часа. Ако е необходимо по-дълго съхранение, пробите могат да се поставят в хладилник при температура 2-8°C за период не повече от един ден. По-дълго съхранение (до 2 седмици) е приемливо при замразяване във фризер при температура минус 20°C. Не се допуска повторно замразяване-размразяване на пробите.

Ако PCR диагностичната лаборатория и процедурата за вземане на проби са географски разделени, тогава пробите трябва да се транспортират в термоси или термоконтейнери при спазване на правилата за съхранение на пробите и правилата за транспортиране на инфекциозни материали.

Екстракция на ДНК от проби

Методът на твърдофазова сорбция, който се състои в добавяне на лизиращ агент, съдържащ разтвор на гуанидин, сорбция на ДНК върху сорбент, многократно промиване и резорбция на ДНК с буферен разтвор, стана широко разпространен. В случай на обработка на серум, плазма или цяла кръв, обикновено се използва методът на фенолна екстракция. Методът включва депротеинизация с фенол/хлороформ, последвано от утаяване на ДНК (или РНК) с етанол или изопропанол. Обработката се извършва в микроцентрофужни епруветки от типа "Eppendor P" с обем 1,5 ml. Времето за обработка е 1,5-2 часа (фиг. 10).

Ориз. 10. Изолиране на ДНК.

Провеждане на PCR

Определено количество от пробата от обработената клинична проба се прехвърля в специална микроцентрофужна епруветка тип Eppendorf с обем 0,2 или 0,5 ml. Към сместа за амплификация, състояща се от вода, PCR буфер, dNTP разтвор, праймер и разтвор се добавя същата епруветка Taq полимераза (добавена към сместа последна) Обикновено обемът на реакционната смес е 25 µl След това една капка минерално масло се добавя към всяка епруветка, за да се предотврати изпаряването на реакционната смес по време на амплификацията Епруветките се прехвърлят в програмируем термостат (усилвател), при който усилването се извършва в автоматичен режим по зададена програма (фиг. 11).

Ориз. единадесет. усилвател " Термоциклер ».

Времето за реакция в зависимост от зададената програма е 2-3 часа. Паралелно с опитните проби се поставят и контролни проби: положителната контрола включва всички компоненти на реакцията, но вместо материала на клиничната проба се въвежда контролен ДНК препарат на изследвания ген. Отрицателната контрола включва всички компоненти на реакцията, но вместо клиничния материал или ДНК препарата се добавя подходящо количество дейонизирана вода или екстракт, който не съдържа изследваната ДНК. Необходима е отрицателна контрола за проверка на компонентите на реакцията за отсъствие на ДНК в тях поради замърсяване и за изключване на фалшиво положителни резултати.

Регистрация на резултатите

Амплифицираният специфичен ДНК фрагмент се открива чрез електрофореза в агарозен гел в присъствието на етидиев бромид. Етидиевият бромид образува стабилно интерстициално съединение с ДНК фрагменти, което се появява като светещи ленти, когато гелът се облъчи с UV лъчение с дължина на вълната 290-330 nm. В зависимост от размера на получените PCR ампликони се използва гел, съдържащ 1,5% до 2,5% агароза. За да се приготви агарозен гел, смес от агароза, буфер и вода се разтопява в микровълнова фурна или на водна баня и се добавя разтвор на етидиев бромид. Охладена до 50-60°C, сместа се излива във формата със слой от 4-6 мм, като с помощта на специални гребени се правят джобове в гела за нанасяне на пробата. Гребените са поставени така, че между дъното на ямките и основата на гела да остане слой агароза 0,5-1 mm. След като гелът се втвърди, върху джобовете се нанася амплификат в количество от 5-15 µl. Препоръчително е да се извърши електрофореза на смес от маркери за дължина на ДНК фрагмента успоредно с контролни и експериментални проби. Обикновено такава смес съдържа десет ДНК фрагмента 100, 200, 300 и т.н. дълги базови двойки.

Създаването на такава проба ви позволява да проверите дължината на ампликоните в контролните и експерименталните проби. Гелът с приложената проба се прехвърля в камера за електрофореза, пълна с буфер, камерата се свързва към източник на захранване и електрофоретичното разделяне на продуктите на амплификация се извършва в продължение на 30-45 минути при сила на електрическо поле 10-15 V/см. В този случай предната част на багрилото, която е част от реакционната смес, трябва да премине най-малко 3 cm.

След края на електрофорезата гелът се прехвърля върху стъклото на трансилюминатора и се гледа в ултравиолетова светлина. За документация гелът се снима върху филм Mikrat 300 или се записва с помощта на видео система, свързана към компютър.

Първо се оценяват контролните проби. В електрофоретичната лента, съответстваща на положителната контрола, трябва да присъства оранжева светеща лента. Неговата електрофоретична мобилност трябва да съответства на дължината на ампликона, посочена в инструкциите.

В електрофоретичната писта, съответстваща на отрицателната контрола, такава лента трябва да липсва. Наличието на такава лента в отрицателната контрола показва замърсяване – замърсяване на реагентите, използвани с изследваната ДНК или ампликон. Тестовите проби се оценяват по наличието в съответната лента на лента, която се намира на същото ниво като лентата в положителната контролна проба. Интензитетът на блясъка на лентата съответства на количеството ДНК, която се изследва в пробата, което позволява полуколичествена оценка на PCR. Обикновено положителните резултати се оценяват по четиристепенна скала. Ако сиянието на лентата в експерименталната проба е много слабо, тогава такава проба трябва да бъде пренаредена (фиг. 12).

Ориз. 12. Електрофореза в агарозен гел.

PCR приложения задиагностика на точкови мутации и генни полиморфизми

Една от водещите области на приложение на PCR в практическото здравеопазване е диагностиката на точкови мутации и генни полиморфизми. . Съществуват директни и индиректни методи за ДНК диагностика. В онези ситуации, когато е известен ген, чието увреждане води до развитие на наследствено заболяване, това увреждане може да бъде открито чрез молекулярно-генетични методи. Такива методи се наричат ​​директни. С помощта на директни методи се откриват нарушения в първичната нуклеотидна последователност на ДНК (мутации и техните видове). Директните методи се характеризират с точност, достигаща почти 100%.

На практика обаче тези методи могат да се прилагат при определени условия.:

с известна цитогенетична локализация на гена, отговорен за развитието на наследствено заболяване;

Генът на болестта трябва да бъде клониран и неговата нуклеотидна последователност да бъде известна.

Целта на директната ДНК диагностика е да се идентифицират мутантни алели.

По този начин, в онези ситуации, когато е известно какъв вид увреждане на ДНК води до наследствено заболяване, ДНК фрагментът, съдържащ увреждането, се изследва директно, т.е. използва се директният метод за ДНК диагностика.

Към днешна дата обаче гените на много заболявания не са картографирани, тяхната екзон-интронна организация е неизвестна, а много наследствени заболявания се характеризират с изразена генетична хетерогенност, която не позволява пълноценно използване на директни ДНК диагностични методи. Следователно, в случаите, когато локализацията на увреждането не е известна, се използва различен подход, свързан с изследване на близостта до гена, отговорен за генното заболяване, в комбинация със семейния анализ, тоест индиректни методи за молекулярно-генетична диагностика се използват наследствени заболявания.

Могат да се използват различни методи за откриване на точкови мутации и малки делеции, но всички те се основават на използването на PCR метода. Тази реакция ви позволява многократно да размножавате нуклеотидната последователност на ДНК и след това да търсите мутации. Методите за търсене на ДНК фрагменти, носещи мутации, се основават на сравнителен анализмутантни и нормални ДНК нуклеотидни последователности.

Анализ на PCR продукти

в процеса на директна ДНК диагностика

Той включва изследване на специфични характеристики на амплифицираната област на гена. По този начин, при заболявания, причинени от експанзия на тринуклеотидни повторения, продуктите на амплификация се различават по дължината си (отразяваща различен брой триплети в изследваната генна област) и в резултат на това по скоростта на движение в гела. Благодарение на това се постига ясно електрофоретично разделяне на нормални и мутантни алели и точно определяне на патологично удължения фрагмент, т.е. ДНК диагностика на заболяването (фиг. 13).

https://pandia.ru/text/78/085/images/image018_18.jpg" width="417" height="110 src=">

Ориз. 14. Диагностика на изтриване GAG в ген DYT 1 при пациенти с допа-независима дистония (електрофореза с полиакриламиден гел). Писти 2,3,6 - болни; ленти 1,4,5 - контрол. Тънката стрелка показва нормалния алел, удебелата стрелка показва мутантния по-къс алел (заличаване на три нуклеотида).

Ако изследваната ДНК област е изцяло включена в разширена делеция, тогава PCR амплификацията на ДНК от този изтрит алел няма да бъде извършена поради липсата на места за хибридизация на праймери. В този случай хомозиготна делеция ще бъде диагностицирана въз основа на пълно отсъствие PCR реакционен продукт (синтезът на ДНК е невъзможен от двете копия на гена). При хетерозиготна делеция е възможно да се идентифицира PCR продукт, синтезиран от нормален (безопасен) алел, но за надеждна диагноза на такава мутация е необходимо да се използват по-сложни методи за визуализация на ДНК, които позволяват да се оцени дозата на крайния PCR продукт.

За откриване на точкови мутации (най-често нуклеотидни замествания) на определени места, PCR методът се използва в комбинация с други методи за молекулярно-генетичен анализ. Ако местоположението и естеството на предложената точкова мутация са точно известни, тогава за целенасоченото откриване на такава мутация, рестрикционни ендонуклеази (рестриктази) са специални клетъчни ензими, изолирани от различни щамове бактерии.

Тези ензими разпознават специфични нуклеотидни последователности с дължина от четири до десет нуклеотида. След това се извършва рестрикция (лат. (изрязване)) на тези последователности като част от двуверижна ДНК молекула.Всеки рестрикционен ензим разпознава и изрязва на фиксирано място строго определена, специфична нуклеотидна последователност - сайт за ограничаване (сайт за разпознаване).

В случаите, когато точкова мутация променя естественото място за разпознаване за конкретен рестрикционен ензим, този ензим няма да може да разцепи мутантния PCR-амплифициран фрагмент. В някои случаи мутацията води до появата на ново място за разпознаване на определен рестрикционен ензим, който отсъства в нормата.

И в двете ситуации мутантните и нормалните PCR продукти, третирани с избрания рестрикционен ензим, ще дадат рестрикционни фрагменти с различна дължина, които могат лесно да бъдат открити чрез електрофореза (фиг. 15).

По този начин, ако е необходимо бързо да се открие някаква конкретна точкова мутация, задачата се свежда до търсене на съответния рестрикционен ензим, чието разпознаващо място е локализирано на мястото на нарушената нуклеотидна последователност. Третирането на PCR продукти с този рестрикционен ензим ще позволи лесно диференциране на нормални и мутантни алели. Рестрикционният анализ значително опростява откриването на известни точкови мутации и в момента се използва широко за директна ДНК диагностика на наследствени заболявания.

финален етап молекулярно-генетичен анализ на мутациие определянето на нуклеотидната последователност на изследвания ДНК фрагмент (секвениране), която се сравнява с нормата и се формулира окончателната генетична диагноза. Благодарение на напредъка в молекулярната генетика, ДНК диагностичните методи вече са разработени за повече от 400 наследствени заболявания.

Ориз. 15. Откриване на точкова мутация с помощта на рестрикционен анализ:А - амплифициращ регион на гена, съдържащ рестрикционен сайтAGCTза рестрикционна ендонуклеазаАлу аз. Мутацияг→ Апроменя тази нуклеотидна последователност, което води до рестрикционен ензимАлуиблокиран; B - електроферограма на рестрикционни продукти: лента 1 - хомозиготност за нормалния алел; лента 2, хомозиготност за мутацията; лента 3 - хетерозиготно състояние (нормален алел + мутация).

Диагностиката на наследствени заболявания въз основа на директно изследване на мутантни алели при пациенти, членове на техните семейства или предполагаеми хетерозиготни носители на патологични мутации е подходяща за предсимптоматична и пренатална диагностика, която може да се приложи при повечето ранни стадииразвитие на плода, преди появата на каквито и да било клинични или биохимични симптоми на заболяването.

Независимо от метода за откриване на мутации, точна молекулярна характеристика на всяка мутация може да бъде получена само чрез директно секвениране. През последните години за автоматизиране на този процес широко се използват специални устройства - секвенсери, които позволяват значително да се ускори процеса на разчитане на ДНК информация.

Пътят за по-широко приложение на молекулярно-биологичните изследвания в клинично-диагностичните лаборатории се открива чрез ускоряване на аналитичния процес чрез извършване на всички процедури в един континуум, без прехвърляне на проба, създаване на условия за предотвратяване на замърсяване при паралелно изследване на редица аналити и с обективна регистрация на резултатите във всеки цикъл.

Основни модификации на PCR метода

Използва се за бързо сканиране и търсене на известни генни мутации.

Multiplex (multiprimer) PCR

Този метод се основава на едновременното усилване на няколко екзона на изследвания ген в една реакция. Това позволява икономичен бърз скрининг на най-често срещаните мутации. Например, за бързо диагностициране на носителя на делеции в гена на дистрофина при пациенти с прогресивна мускулна дистрофия на Дюшен/Бекер, се извършва едновременно амплификация на набора от най-често мутиращи екзони на този ген. Тъй като тези заболявания се унаследяват в Х-свързан рецесивен тип и са свързани с увреждане на единствената Х хромозома при момчета, в случай на продължителна делеция, електрофорезата на реакционните продукти ще разкрие отсъствието на един или повече ДНК фрагменти (екзони ), което може да служи като молекулярно потвърждение на диагнозата. Освен това, чрез избор на специфични генни региони за PCR амплификация, е възможна доста точна оценка на общата дължина на точките на делеция и прекъсване на гена (до екзона).

Комбинираното използване на няколко мултиплексни реакции дава възможност да се диагностицират до 98% от всички делеции, които се появяват при пациенти с прогресивна мускулна дистрофия на Дюшен/Бекер. Това е приблизително 60% от общ бройизвестни мутации в гена на дистрофина и показва много висока ефективност на този скрининг метод за ДНК диагностика на дистрофинопатия (фиг. 16).

Ориз. 16. Директна ДНК диагностика на мускулна дистрофия на Дюшен с помощта на мултиплексна PCR (електрофореза в агарозен гел). Във всеки един от изследваните индивиди едновременно са амплифицирани четири екзона на гена на дистрофина (екзони 17, 19, 44 и 45; стрелките показват съответните продукти на амплификация). Лента 1 - контрола, ленти 2-5 - пациенти с мускулна дистрофия на Дюшен с различни делеции на гена на дистрофина (ленти 2 и 5 - делеция на екзон 45, лента 3 - делеция на екзон 44, лента 4 - делеция на екзон 17 и 19 ).

Алел-специфично усилване

Методът се основава на използването на две независими двойки праймери за специфичен регион на гена: един праймер и в двете двойки е общ, а вторият праймер във всяка двойка има различна структура и е комплементарен на нормални или мутантни ДНК последователности . В резултат на такава реакция в разтвор могат да се синтезират едновременно два вида PCR продукти - нормални и мутантни. Освен това, дизайнът на използваните праймери позволява ясно да се разграничат нормалните и мутантните продукти на амплификация по техния молекулен размер. Този метод е много ясен и ви позволява да проверите както хомо-, така и хетерозиготното носене на мутантния алел.

Метод за сайт-насочена модификация на амплифицирана ДНК

Методът се основава на използването в PCR на така наречения праймер за несъответствие (не е напълно комплементарен на шаблона), който се различава от шаблонната ДНК последователност с един нуклеотид. В резултат на включването на посочения праймер в състава на мутантния PCR продукт, в него се образува изкуствено създадено рестрикционно място за една от рестрикционните ендонуклеази, което позволява директна ДНК диагностика на определена известна мутация чрез рестрикционен анализ. Създаването на такова изкуствено рестрикционно място може да се наложи, ако търсенето не разкри съществуването на известен и достъпен ензим, чийто „естествен” рестрикционен сайт е засегнат в резултат на появата на изследваната мутация в молекулата на ДНК .

PCR метод с обратна транскриптаза (RT- PCR)

Този метод се използва в случаите, когато е по-удобно да се използва не геномна ДНК като обект на изследване, а по-компактна и информационно "наситена" кДНК, получена след подходяща обработка на тъканни проби, например биопсичен материал или клетъчни линии на лимфоцити , фибробласти и др. Важно условие тук е експресията (поне минимална) на желания ген в изследваната тъкан.

На първия етап се извършва обратна транскрипция на иРНК и получените сДНК молекули служат като матрица за PCR. Впоследствие критичната сДНК област, амплифицирана в достатъчно количество, се подлага на секвениране и други методи за скрининг на мутации, директно електрофоретично изследване (откриване на делеции, инсерции и т.н.) или интегриране в експресионна система с цел получаване на протеинов продукт и неговия директен анализ .

Този метод е особено ефективен за откриване на мутации, водещи до синтеза на "скъсен" протеин (безсмислени мутации, сплайсинг мутации, големи делеции) - така наречения PTT анализ (Protein Truncation Test). PTT анализът обикновено се използва при изследване на разширени мултиекзонни гени, като гена за мускулна дистрофия на Duchenne/Becker, атаксия-телеангиектазия или неврофиброматоза тип 1.

PCR в реално време(PCR в реално време)

Всяка година в практическото здравеопазване PCR в реално време става все по-популярен диагностичен метод. Основната му характеристика е наблюдението и количествения анализ на натрупването на продукти от полимеразна верижна реакция и автоматично регистриране и интерпретация на резултатите. Този метод не изисква етап на електрофореза, което намалява изискванията за PCR лаборатория. Благодарение на спестяването на производствени площи, намаляването на броя на персонала и търсенето на ДНК/РНК количествено определяне, този метод се използва успешно през последните години в най-големите санитарно-епидемични, диагностични и изследователски центрове в развитите страни по света, заменя PCR в настоящия му („класически“) формат.

PCR в реално време използва флуоресцентно белязани олигонуклеотидни сонди за откриване на ДНК по време на амплификация. PCR в реално време позволява пълен анализ на проба в рамките на 20-60 минути и е теоретично в състояние да открие дори една молекула ДНК или РНК в пробата.

Ориз. 17. PCR в реално време.

PCR в реално време използва системата TaqMan за контролиране на кинетиката на PCR директно по време на амплификация, използвайки резонансно гасене на флуоресценцията. За откриване се използва сонда, носеща флуорофор и гасител, комплементарни към средната част на амплифицирания фрагмент. Когато флуорофорът и гасителят са свързани с олигонуклеотидната сонда, се наблюдава само малко количество флуоресцентно излъчване. По време на процеса на амплификация, поради 5'-екзонуклеазната активност на Taq полимеразата, флуоресцентният етикет преминава в разтвор, освобождавайки се от близост до гасителя, и генерира флуоресцентен сигнал, който се увеличава в реално време пропорционално на натрупването на усилва (фиг. 17).

Основни предимства на PCR-Real-Time пред PCR с гел електрофореза:

Целият метод се извършва в една епруветка;

· Методът отнема 1 час;

Достатъчно 1-2 работни стаи;

Наред с качествената оценка на резултата става възможно да се определи количествено (например, когато се предписва антивирусна терапия за СПИН или вирусен хепатит, е необходимо да се знае вирусния товар, т.е. количеството вирус на 1 единица, което осигурява реално -време PCR);

· Драматично намалява риска от замърсяване.

Заключение

PCR методът е един от най-разпространените методи за молекулярно-биологични изследвания. Този метод трябва да се използва смислено от клиницистите, а лекар, който реши да използва PCR в работата си, трябва да има определени познания за характеристиките и възможностите на този метод. Второ, трябва да има тясна обратна връзка между клинициста и PCR лабораторията, която е необходима за анализа на сложни случаи и разработването на правилната диагностична стратегия. На трето място, PCR анализът не е панацея в диагностиката (предимно на инфекциозни заболявания) и не замества съществуващите методи на изследване, а само ги допълва. И най-важното, PCR не може да замени интуицията и аналитичното мислене, които трябва да има лекар, който очаква успех.

П . С . Молекулярно-биологични изследвания - смяна на ориентири за диагностика и лечение. Използването на молекулярно-биологични методи е свързано с перспективата за радикална промяна в акцента в лабораторната диагностика. Можем да говорим не само за навременна информация, а за нейното предварително получаване. Ако сега лабораторните изследвания в повечето случаи се извършват вече с напреднало заболяване и е започнато лечение, тогава се очаква молекулярно-биологичната лабораторна информация да позволи да се идентифицира склонността на човек към определени видове патология и степента на чувствителност към определени лекарства, които ще позволи да се обоснове предсказуем, превантивен и персонализиран характер на медицината на бъдещето.

ПРОМЯНА НА ДИАГНОСТИКАТА И ФОКУСИТЕ НА ЛЕЧЕНИЕТО

НАСЛЕДНИ БОЛЕСТИ

Днес В бъдещето

Диагноза Генетичен паспорт

8. Колко работни помещения са необходими за PCR лаборатория с флуоресцентна детекция (количествен анализ, PCR в реално време)?

9. Какво е откриване?

10. Какви методи на ДНК диагностика се разграничават?

11. Кой ензим работи на базата на PCR?

12. Защо зоната за откриване трябва да бъде отделена от другите работни зони?

13. Какво е сайт с ограничения?

14. Каква е разликата между директния метод на ДНК диагностика и индиректния?

15. Какво е секвениране?

16. Какво е мултиплексна PCR?

17. Какви видове мутации се определят чрез PCR?

18. Какво е замърсяване?

19. Каква е същността на алел-специфичния метод на амплификация?

20. Условия за съхранение на PCR материал?

21. Какво устройство се използва за усилване?

22. Какъв е методът на PCR с обратна транскриптаза (RT-PCR)?

23. Какъв е материалът за PCR диагностика?

24. Избройте видовете замърсяване?

Тестове за самообучение

1. Рестрикционни ендонуклеази:

а) ензими, които „разбиват“ ДНК на строго определени места;

б) ензими, които шият прекъсвания в молекулата на ДНК;

в) ензими, които осигуряват съединения, които извършват възстановяване на ДНК.

2. Генна амплификация:

3. Кой от методите на молекулярната генетика се използва за диагностициране на заболявания, причинени от мутантен ген с известна последователност?

а) използването на специфична рестриктаза;

б) директно откриване с помощта на специфични молекулярни сонди;

в) семеен анализ на разпределението на полиморфизма на дължината на нормалния рестрикционен фрагмент.

4. ДНК последователност:

а) идентифициране на ДНК базовата последователност;

б) многократно повторение на всеки ДНК сегмент;

в) изолиране на ДНК фрагмент, съдържащ изследвания ген.

5. ДНК проби могат да бъдат получени чрез :

б) хорионни въси;

в) околоплодна течност;

г) клетки от околоплодна течност;

д) биопсии на кожа, мускули, черен дроб,

д) всичко е правилно, с изключение на точка "в",

ж) всичко е правилно, с изключение на точка "d",

з) Всичко по-горе е правилно.

6. Кои мутации се диагностицират чрез PCR?

а) геномна;

б) хромозомни;

в) ген (точка).

7. Грундът е:

а) допълнителен участък от ДНК;

б) белязана (радиоактивно или флуоресцентно) синтетичен олигонуклеотид последователност, комплементарна на мутантен или нормален ген;

в) олигонуклеотид, действащ като "семе" и иницииращ синтеза на полинуклеотидна верига върху ДНК или РНК шаблон.

8. Кой разработи принципа на PCR метода?

б) К. Мълис

9. Използва ли се PCR методът за диагностициране на експанзията на тринуклеотидни повторения (динамичен тип мутации)?

10. В какви области се използва PCR?

а) клинична медицина;

б) определение за трансгенни организми (ГМО)

в) идентификация на лицето, установяване на бащинство, криминалистика

г) всичко по-горе

г) нито едно от горните.

Примерни отговори: 1 - а; 2 - б; 3 - б; 4 - а; 5 - д; 6 - в; 7 - в; 8 - б; 9 – а, 10 – г.

Основен

1. Бочкова генетика. Москва. ГЕОТАР, 2002 г.

Допълнителен

1., Бахарев и лечението на вродени и наследствени заболявания при деца. - Москва, 2004г.

2. ДНК диагностика и медико-генетично консултиране. - Москва, 2004г.

3. Генетика на Гинтер. - Москва, 2003г.

4. Горбунов Основи на медицинската генетика. - Санкт Петербург: Интермедика, 1999.

5. J. McGee. Молекулярна клинична диагностика. – Свят, 1999 г.

6. Меншиков - биологични изследвания в клиничната лабораторна диагностика: възможностите на проблема (лекции). Клинична лабораторна диагностика, № 3, 2006.

7. Корниенко от работата на PCR лабораторията по време на инлайн анализа на биологичен материал. Клинична лабораторна диагностика, No10, 2006г.

8. Организация на работата на PCR лабораторията. Методически указания. MU 1.3.1794-03. Главен санитарен лекар на Руската федерация, 2003 г.

9. Erlich H. A. PCR технология. – Перчин-Елмер Цетус, 1993 г.

10. Heid C. A., Stevens J. Количествен PCR в реално време. Геном Res. - бр.6, 1996г.

ОСНОВНИ ПРИНЦИПИ НА МЕТОДА

ПОЛИМЕРАЗНА ВЕРИЖНА РЕАКЦИЯ

Методическо ръководство за извънкласна работа на студенти от 3-4 курса по специалностите обща медицина (060101) и педиатрия (060103).

SEI HPE "Красноярска държавна медицинска академия на Федералната агенция за здраве и социално развитие"

Русия, Красноярск,

Полимеразната верижна реакция е известна от 30 години. Той се използва широко в много области, от археология до генетика.

Именно PCR методът помага за установяване на бащинство, но най-често се използва за откриване на различни инфекциозни заболявания в човешкото тяло.

Как се извършва PCR анализ и какво представлява? Ще се опитаме да отговорим подробно на тези въпроси.

PCR анализ - какво е това?

Полимеразната верижна реакция (PCR) е високоточен метод за молекулярно-генетична диагностика, който дава възможност за откриване на различни инфекциозни и наследствени заболявания при хората, както в остър, така и в хроничен стадий, и много преди болестта да се прояви.

PCR методът е абсолютно специфичен и при правилно изпълнение не може да даде фалшиво положителен резултат. Тоест, ако няма инфекция, тогава анализът никога няма да покаже, че е. Ето защо сега много често, за да се потвърди диагнозата, се взема допълнителен PCR анализ за определяне на патогена и неговата природа.

Полимеразната верижна реакция (PCR) е разработена през 1983 г. от Кери Мълис (САЩ), за която е удостоен с Нобелова награда по химия през 1993 г.

Какво е предимството на този метод?

Диагнозата по този метод ви позволява да намерите патогена директно в гена, съдържащ се в изследваните материали. Това е най-точният анализ за полови инфекции, латентни инфекции, различни полово предавани болести.

Разлики между PCR диагностика и други методи лабораторни изследвания са както следва:

• методът е насочен към идентифициране на самия патоген;
• диагностиката чрез PCR е многостранна: за откриване на няколко патогена;
• заболявания, достатъчна е само една биологична проба от пациента;
• методът е силно чувствителен и не е придружен от други кръстосани реакции.

В допълнение, предимството на PCR диагностиката е, че всеки биологичен материал на пациента е подходящ за анализ: кръв, секрети от гениталните органи, урина, сперма.

Какви инфекции могат да бъдат открити чрез PCR намазка?

В тялото може да има голям брой инфекциозни агенти, включително „скрити“, които не се проявяват дълго време.

PCR анализ на намазка прави възможно откриването на такива инфекции:

• уреплазмоза на гениталните органи;
• кандидоза ();
• херпес;
• наличието на ракови клетки;
• оценка на хормоналното състояние;

Изследваният материал за PCR обикновено е храчка, слюнка, урина, кръв. Преди да извършите анализа, е необходимо внимателно да се подготвите за него, след като сте получили предварителна консултация с лекар.

Кръвта за PCR обикновено се дарява на празен стомах. Добри резултати показват анализите, когато материалът за изследване се взема от цервикалния канал или уретрата. В този случай е най-добре да се извърши PCR диагностика не по-късно от един ден след полов акт.

Разновидности на PCR

PCR се използва в много области за анализ и в научни експерименти. Има различни методи за анализ:

1. PCR с обратна транскрипция(PCR с обратна транскрипция, RT-PCR (на английски)) – използва се за амплифициране, изолиране или идентифициране на известна последователност от РНК библиотека.
2. Обърнат PCR(Inverse PCR (английски)) – използва се, ако е известна само малка площ в желаната последователност. Този метод е особено полезен, когато е необходимо да се определят съседни последователности, след като ДНК е била вмъкната в генома.
3. Nested PCR се използва за намаляване на броя на страничните продукти на реакцията. Използвайте два чифта праймери и извършете две последователни реакции.
4. Асиметричен PCR(на английски Asymmetric PCR) - провежда се, когато е необходимо да се амплифицира основно една от веригите на оригиналната ДНК. Използва се в някои техники за анализ на секвениране и хибридизация.
5. Количествен PCR(Quantitative PCR, Q-PCR (на английски)) или PCR в реално време - използва се за директно наблюдение на измерването на количеството на конкретен PCR продукт във всеки реакционен цикъл.
6. Stepped PCR (Touchdown PCR (английски)) - с помощта на този подход се намалява влиянието на неспецифичното свързване на праймерите.
7. Групово специфичен PCR(English group-specific PCR) - PCR за свързани последователности в рамките на един или между различни видове, като се използват консервативни праймери за тези последователности.

Ако нуклеотидната последователност на матрицата е частично известна или изобщо не е известна, могат да се използват изродени праймери, чиято последователност съдържа дегенерирани позиции, в които могат да бъдат разположени всякакви бази. Например, праймерната последователност може да бъде: ...ATH... където H е A, T или C.

Какви биологични материали се изучават?

Различни биологични среди и човешки течности могат да служат като материал за PCR изследвания, в които може да се открие чужда ДНК на бактерия или ДНК или РНК на вирус:

1. урина. Може да се използва при инфекциозни лезии на пикочно-половите пътища при мъжете и пикочните органи при жените (при мъжете използването на урина като материал замества епителното остъргване).
2. храчки. Използва се за диагностика на туберкулоза и по-рядко за диагностика на респираторни форми на хламидия и микоплазмоза. Храчките в количество от 15-20 ml се събират в стерилен (за еднократна употреба) флакон.
3. биологични течности. По показания се вземат простатен сок, плеврална, гръбначно-мозъчна, околоплодна течност, ставна течност, бронхоалвеоларен лаваж, слюнка.
4. Епителни остъргвания от лигавиците. Обикновено се използва за диагностициране на полово предавани болести (STD), като гонорея, хламидия, микоплазмоза, уреаплазмоза, трихомониаза, гарднерелоза, херпес и други инфекции, които засягат лигавиците.
5. Биопсии. Най-често използваните биопсични проби от стомаха и дванадесетопръстниказа откриване на инфекция с Helicobacter pylori.
6. Кръв, плазма, серум. Използва се за PCR анализ на хепатит B, C, D, G вируси, херпес, CMV, HIV, човешки гени.

Как да се подготвим за анализа?

Надеждността на PCR резултата директно зависи от правилността на доставката на материала за изследване. Материалът не трябва да бъде замърсен, в противен случай резултатът от изследването няма да бъде обективен. Най-важните препоръки преди провеждане на PCR тест включват следните изисквания:

1. Урината се дава сутрин в стерилен контейнер.
2. Кръвен тест за инфекции трябва да се вземе сутрин на празен стомах.
3. Не трябва да сте сексуално активни в деня преди теста.

Резултатът от анализа ще бъде готов след 1,5-2 дни след въпросната процедура. Има ситуации, когато резултатът може да бъде приготвен в същия ден.

Дешифриране на анализа на PRP

Процесът на интерпретация на представеното изследване се отличава със своята простота. Резултатите от PCR анализа могат да бъдат получени 1,5-2 дни след доставката на материала. В някои случаи резултатът е готов още на първия ден и това може да означава:

• Отрицателен резултатпоказва, че диагностицираният материал не съдържа желания инфекциозен агент.
• PCR положителенпоказва, че ДНК или РНК на патогена присъства в човешкото тяло.

В някои случаи се извършва количествено определяне на микроорганизми. Това е особено вярно при заболявания, причинени от опортюнистични патогени. Тъй като тези бактерии показват отрицателните си ефекти само когато са в излишък.

Също така, количественият PCR анализ е важен за избора на терапевтична тактика и за целите на наблюдението на лечението на такива вирусни инфекциикато вирусите на ХИВ и хепатит.

Колко точен е PCR при диагностициране на инфекции?

PCR методът се характеризира с висока точност, специфичност и чувствителност. Означава, че този анализспособен на:

• точно да се определи наличието или отсъствието на инфекция;
• посочете точно какъв вид инфекция е (специфичност);
• откриване на инфекция дори при много ниско съдържание на микробна ДНК в биологичния материал,
• който е тестван (чувствителност).

PCR анализ: цена и условия

Цената на конкретен анализ ще зависи от това за коя инфекция ще бъдете тествани. Приблизителни цени и срокове:

1. STI: 300-500 рубли, срокове - 1 ден;
2. Вирус на Epstein-Barr, човешки папиломен вирус, херпес, цитомегаловирус: 300-500 рубли, срокове - 1 ден;
3. Хепатит A, B, C, D, G: качествен анализ 650 рубли, количествен анализ 2000 рубли. Срокове - до 5 дни;
4. Антитела към вируса на хепатит С, общо (Anti-HCV) - 420 рубли;
5. Антитела към вируса на хепатит С, IgM (Anti-HCV IgM) - 420 рубли;
6. хеликобактер пилори ( Хеликобактер пилори): 300-400 рубли, срокове - 1 ден;
7. ХИВ (антитела и антигени) - 380 рубли;
8. ХИВ РНК, качествено - 3500 рубли;
9. ХИВ РНК, количествено - 11 000 рубли.

За да спестите пари, можете да изберете фиксиран пакет от анализи. Тази услуга се предоставя от повечето клиники, където можете да направите анализ по метода PRC (ин витро, онклинични и др.).